DRIP-seq

DRIP-seq (secuenciación DRIP) es una tecnología para el perfilado genómico de un tipo de híbrido ADN-ARN llamado " bucle R ". ^{[ 1 ]} DRIP-seq utiliza un anticuerpo independiente de la secuencia pero específico de la estructura para la inmunoprecipitación de ADN-ARN (DRIP) para capturar bucles R para la secuenciación masiva paralela de ADN . ^{[ 1 ]}

Un bucle R es una estructura de ácido nucleico de tres hebras , que consta de un dúplex híbrido de ADN-ARN y una hebra de ADN monocatenario (ssDNA) desplazada. ^{[ 2 ]} Los bucles R se forman predominantemente en regiones genómicas ricas en citosina durante la transcripción ^{[ 2 ]} y se sabe que participan en la expresión génica y el cambio de clase de inmunoglobulina . ^{[ 1 ] [ 3 ] [ 4 ]} Se han encontrado en una variedad de especies, desde bacterias hasta mamíferos. ^{[ 2 ]} Se localizan preferentemente en promotores de islas CpG en células humanas y en regiones altamente transcritas en levaduras. ^{[ 1 ] [ 3 ]}

En condiciones anormales, a saber, una producción elevada de híbridos ADN-ARN, los bucles R pueden causar inestabilidad genómica al exponer el ADN monocatenario a daños endógenos ejercidos por la acción de enzimas como AID y APOBEC , o a una sobreexposición a especies químicamente reactivas. ^{[ 4 ]} Por lo tanto, comprender dónde y en qué circunstancias se forman los bucles R en todo el genoma es crucial para una mejor comprensión de la inestabilidad genómica. La caracterización de los bucles R se limitaba inicialmente a enfoques específicos de locus. ^{[ 5 ]} Sin embargo, con la llegada de las tecnologías de secuenciación masiva en paralelo y posteriormente de derivados como DRIP-seq, se ha abierto la posibilidad de investigar genomas completos en busca de bucles R.

DRIP-seq se basa en la alta especificidad y afinidad del anticuerpo monoclonal (mAb) S9.6 hacia híbridos de ADN-ARN de diversas longitudes. El mAb S9.6 se creó y caracterizó por primera vez en 1986 y actualmente se utiliza para la inmunoprecipitación selectiva de bucles R. ^{[ 6 ]} Desde entonces, se ha utilizado en diversos métodos de inmunoprecipitación para la caracterización de bucles R. ^{[ 1 ] [ 3 ] [ 7 ] [ 8 ]} El concepto detrás de DRIP-seq es similar a ChIP-sequencing ; los fragmentos de bucles R son el principal material inmunoprecipitado en DRIP-seq.

La técnica DRIP-seq se utiliza principalmente para el mapeo genómico de bucles R. La identificación de los sitios de formación de bucles R permite estudiar diversos eventos celulares, como la función de la formación de bucles R en regiones específicas, la caracterización de estas regiones y su impacto en la expresión génica. También puede utilizarse para estudiar la influencia de los bucles R en otros procesos, como la replicación y la síntesis del ADN. Indirectamente, la técnica DRIP-seq puede aplicarse a líneas celulares mutantes deficientes en genes implicados en la resolución de bucles R. ^{[ 3 ]} Este tipo de estudios proporciona información sobre las funciones del gen mutado en la supresión de la formación de ADN-ARN y, potencialmente, sobre la importancia de los bucles R en la inestabilidad genómica.

La técnica DRIP-seq se utilizó por primera vez para el análisis genómico de bucles R en humanos, lo que reveló la formación generalizada de bucles R en los promotores de las islas CpG. ^{[ 1 ]} En particular, los investigadores descubrieron que la formación de bucles R está asociada con el estado no metilado de las islas CpG.

Posteriormente, se utilizó DRIP-seq para perfilar la formación de bucles R en los sitios de inicio y terminación de la transcripción en células pluripotentes humanas Ntera2 . ^{[ 7 ]} En este estudio, los investigadores revelaron que los bucles R en los extremos 3' de los genes pueden estar correlacionados con la terminación de la transcripción.

Para detectar sitios de formación de bucles R, los cientos de millones de lecturas de secuenciación de DRIP-seq se alinean primero con un genoma de referencia mediante un alineador de secuencias de lectura corta ; luego, se pueden utilizar métodos de detección de picos diseñados para ChIP-seq para evaluar las señales DRIP. ^{[ 1 ]} Si se utilizaron diferentes cócteles de enzimas de restricción para diferentes experimentos de DRIP-seq de la misma muestra, se detectan picos de consenso de DRIP-seq. ^{[ 7 ]} Normalmente, los picos se comparan con los de una muestra correspondiente tratada con RNasa H1 , que sirve como control de entrada. ^{[ 1 ] [ 7 ]}

Se han desarrollado varias herramientas computacionales, bases de datos y marcos analíticos para la predicción, anotación, visualización y análisis integrador de conjuntos de datos de bucles R y DRIP-seq, incluyendo QmRLFS-finder, DROPA, R-loopBase y RLBase. ^{[ 9 ] [ 10 ] [ 11 ] [ 12 ]}

Debido a la ausencia de otro método basado en anticuerpos para la inmunoprecipitación de bucles R, la validación de los resultados de DRIP-seq resulta difícil. Sin embargo, los resultados de otros métodos de perfilado de bucles R, como DRIVE-seq, pueden utilizarse para medir el consenso.

Por otro lado, DRIP-seq se basa en plataformas de secuenciación de lectura corta existentes para la secuenciación de bucles R. En otras palabras, todas las limitaciones inherentes a estas plataformas también se aplican a DRIP-seq. En particular, las plataformas típicas de secuenciación de lectura corta producirían una cobertura de lectura desigual en regiones ricas en GC. La secuenciación de bucles R largos podría representar un desafío, ya que estos se forman predominantemente en regiones de ADN ricas en citosina. Además, las regiones ricas en GC tienden a tener una baja complejidad por naturaleza, lo que dificulta que los alineadores de lectura corta produzcan alineamientos únicos.

Aunque existen otros métodos para el análisis y la caracterización de la formación de bucles R, ^{[ 5 ] [ 13 ] [ 14 ] [ 15 ] [ 16 ] [ 17 ] [ 18 ] [ 19 ] [ 20 ]} solo unos pocos proporcionan cobertura y robustez a escala genómica. ^{[ 1 ] [ 3 ]}

• Modificación y secuenciación con bisulfito no desnaturalizante : Este método consiste en un tratamiento con bisulfito seguido de secuenciación y se basa en el efecto mutagénico del bisulfito de sodio sobre el ADN monocatenario. Aunque este método se utiliza principalmente para localizar promotores específicos de islas CpG, ^{[ 1 ]} se ha utilizado para detectar bucles R a pequeña escala ^{[ 5 ]} y otros sitios frágiles de ADN monocatenario. ^{[ 21 ]}
• Enriquecimiento in vitro de ADN:ARN (DRIVE-seq) : ^{[ 1 ]} Este método comparte principios muy similares a DRIP-seq, excepto por el uso de la endonucleasa MBP-RNASEH1 en lugar del mAb S9.6 para la recuperación de bucles R. MBP-RNASEH1 proporciona una alternativa al mAb S9.6 cuando se necesita un ensayo de captura adicional; sin embargo, la sobreexpresión de esta endonucleasa puede introducir riesgos citotóxicos in vivo .
• Inmunoprecipitación de ADN:ARN seguida de hibridación en microarrays de mosaico (DRIP-chip) : ^{[ 3 ]} Este método también se basa en el uso del anticuerpo monoclonal S9.6. Sin embargo, en lugar de ingresar a una cadena de secuenciación, el material inmunoprecipitado en DRIP-chip se hibrida a un microarray . Una ventaja de DRIP-chip sobre DRIP-seq es la rápida obtención de datos. Los factores limitantes de esta técnica son el número de sondas en los microarrays de chip y la ausencia de información de secuencia de ADN.

• inmunoprecipitación
• Secuenciación ChIP
• secuenciación de ADN