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elemento de desenrollamiento del ADN

El desenrollamiento del ADN en el DUE permite la formación de una horquilla de replicación para que se produzca la replicación del ADN. Un elemento de desenrollamiento de ADN ( ...

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El desenrollamiento del ADN en el DUE permite la formación de una horquilla de replicación para que se produzca la replicación del ADN.

Un elemento de desenrollamiento de ADN ( DUE o DNAUE ) es el sitio de iniciación para la apertura de la estructura de doble hélice del ADN en el origen de replicación para la síntesis de ADN . [ 1 ] Es rico en AT y se desnaturaliza fácilmente debido a su baja estabilidad helicoidal, [ 2 ] lo que permite que la región de cadena simple sea reconocida por el complejo de reconocimiento del origen .

Los DUE se encuentran tanto en organismos procariotas como eucariotas , pero fueron descubiertos por primera vez en orígenes de levaduras y bacterias por D. Kowalski y MJ Eddy. [ 1 ] El desenrollamiento del ADN permite el acceso de la maquinaria de replicación a las nuevas hebras simples. [ 1 ] En eucariotas, los DUE son el sitio de unión para las proteínas de unión al elemento de desenrollamiento del ADN (DUE-B) necesarias para la iniciación de la replicación. [ 3 ] En procariotas, los DUE se encuentran en forma de secuencias consenso en tándem que flanquean el extremo 5' del dominio de unión de DnaA. [ 2 ] El acto de desenrollamiento en estos elementos ricos en AT ocurre incluso en ausencia de cualquier proteína de unión al origen debido a fuerzas de superenrollamiento negativas , lo que lo convierte en una acción energéticamente favorable. [ 2 ] Los DUE se encuentran típicamente abarcando 30-100 pb de orígenes de replicación. [ 4 ] [ 5 ]

Función

El desenrollamiento específico del DUE permite el ensamblaje del complejo de iniciación en el sitio de replicación en el ADN monocatenario. La helicasa de ADN y las enzimas asociadas ahora pueden unirse a la región desenrollada, creando un inicio de horquilla de replicación . El desenrollamiento de esta región de doble cadena está asociado con un requerimiento de energía libre bajo, debido a la inestabilidad helicoidal causada por interacciones específicas de apilamiento de bases, en combinación con el superenrollamiento contrarrestado. [ 4 ] [ 6 ] El superenrollamiento negativo permite que el ADN sea estable al fundirse, impulsado por la reducción del estrés torsional. [ 5 ] Se encuentra en los orígenes de replicación tanto de bacterias como de levaduras, así como presente en algunos de mamíferos. [ 5 ] Se ha encontrado que tiene entre 30 y 100 pb de longitud. [ 4 ] [ 5 ]

procariotas

En los procariotas, la replicación del ADN suele ocurrir a partir de un único origen de replicación en una única hebra de la secuencia de ADN. Ya sea que este genoma sea lineal o circular, las bacterias poseen la maquinaria necesaria para que se produzca la replicación. [ 7 ]

Proceso

En las bacterias, la proteína DnaA es el iniciador de la replicación. [ 8 ] Se carga en oriC en una secuencia de caja DnaA donde se une y ensambla filamentos para abrir el dúplex y reclutar la helicasa DnaB con la ayuda de DnaC . DnaA está altamente conservada y tiene dos dominios de unión al ADN. Justo antes de esta caja DnaA, hay tres secuencias en tándem de 13 nucleótidos. Estas secuencias en tándem, etiquetadas como L, M y R de 5' a 3', son los DUE bacterianos. Dos de estas tres regiones ricas en AT (M y R) se desenrollan al unirse DnaA a la caja DnaA, debido a su proximidad al dúplex en desenrollamiento. La secuencia final de 13 nucleótidos, L, la más alejada de esta caja DnaA, finalmente se desenrolla cuando la helicasa DnaB la rodea. Esto forma una burbuja de replicación para que la replicación del ADN continúe. [ 2 ]

Las arqueas utilizan un homólogo más simple del complejo de reconocimiento del origen eucariota para encontrar el origen de replicación, en secuencias denominadas caja de reconocimiento del origen (ORB). [ 9 ]

Favorabilidad

El desenrollamiento de estos tres DUE es un paso necesario para que se inicie la replicación del ADN. La fuerza de tracción ejercida por la fusión del dúplex en la secuencia de la caja DnaA induce una mayor fusión en los sitios DUE M y R. El sitio L, más distante, se desenrolla mediante la unión de DnaB. El desenrollamiento de estos sitios de 13 nucleótidos es independiente de las proteínas de unión a oriC. Es la generación de superenrollamiento negativo lo que provoca el desenrollamiento. [ 2 ]

Las tasas de desenrollamiento del ADN en los tres DUE de E. coli se compararon experimentalmente mediante espectroscopia de resonancia nuclear. En condiciones fisiológicas, la eficiencia de apertura de cada una de las secuencias ricas en AT difirió entre sí. Esto se debe principalmente a las diferentes secuencias circundantes distantes. [ 2 ]

Además, se observó que la fusión de los pares de bases AT/TA era mucho más rápida que la de los pares GC/CG (15-240 s⁻¹ frente a ~20 s⁻¹ ) . Esto respalda la idea de que las secuencias AT son favorecidas evolutivamente en los elementos DUE debido a su facilidad de desenrollamiento. [ 2 ]

Secuencia de consenso

Las tres secuencias de 13 nucleótidos identificadas como DUE en E. coli están bien conservadas en el origen de replicación de todas las bacterias entéricas documentadas . Se creó una secuencia consenso general mediante la comparación de bacterias conservadas para formar una secuencia de 11 bases, GATCTnTTnTTTT . E. coli contiene 9 bases de la secuencia consenso de 11 bases en su oriC, dentro de las secuencias de 13 nucleótidos. Estas secuencias se encuentran exclusivamente en el único origen de replicación; no en ningún otro lugar de la secuencia del genoma. [ 2 ]

Eucariotas

Los mecanismos de replicación eucariotas funcionan de forma relativamente similar a los de los procariotas, pero bajo una regulación más precisa. [ 10 ] Es necesario asegurar que cada molécula de ADN se replique solo una vez y que esto ocurra en el lugar y momento adecuados . [ 7 ] Opera en respuesta a señales extracelulares que coordinan el inicio de la división, de manera diferente en cada tejido. Las señales externas desencadenan la replicación en la fase S mediante la producción de ciclinas que activan las quinasas dependientes de ciclinas (CDK) para formar complejos. [ 10 ]

La replicación del ADN en eucariotas se inicia cuando el complejo de reconocimiento del origen (ORC) se une al origen. Esto ocurre en la fase G1 del ciclo celular , impulsando el avance celular hacia la fase S. Esta unión permite la unión de otros factores para crear un complejo prereplicativo (pre-RC). El pre-RC se activa cuando la quinasa dependiente de ciclina (CDK) y la quinasa dependiente de Dbf4 (DDK) se unen a él. Los complejos de iniciación permiten entonces el reclutamiento del activador de la helicasa MCM, Cdc45, y el posterior desenrollamiento del dúplex en el origen. [ 10 ] [ 11 ]

La replicación en eucariotas se inicia en múltiples sitios de la secuencia, formando simultáneamente múltiples horquillas de replicación . Esta eficiencia es necesaria debido a los grandes genomas que deben replicar. [ 10 ]

En eucariotas, las estructuras de nucleosomas pueden complicar el inicio de la replicación. [ 4 ] Pueden bloquear el acceso de DUE-B al DUE, suprimiendo así el inicio de la transcripción. [ 4 ] Pueden impedir la velocidad. Sin embargo, la naturaleza lineal del ADN eucariota, en comparación con el ADN circular procariota, facilita el desenrollamiento de su dúplex una vez que se ha desenrollado correctamente del nucleosoma. [ 4 ] La actividad del DUE puede ser modulada por factores de transcripción como ABF1. [ 4 ]

Levadura

Un sistema modelo común de levadura que representa bien la replicación eucariota es Saccharomyces cerevisiae . [ 12 ] Posee secuencias de replicación autónoma (ARS) que se transforman y mantienen bien en un plásmido . Se ha observado que algunas de estas ARS actúan como orígenes de replicación. Estas ARS están compuestas por tres dominios: A, B y C. El dominio A es donde reside la secuencia consenso de ARS , denominada ACS . El dominio B contiene la DUE. Por último, el dominio C es necesario para facilitar las interacciones proteína-proteína . [ 12 ] Las ARS se encuentran distribuidas en 16 cromosomas, repetidas cada 30–40 kb. [ 12 ]

Entre especies, estas secuencias ARS son variables, pero sus dominios A, B y C están bien conservados. [ 12 ] Cualquier alteración en el DUE (dominio B) provoca una menor función general del ARS en su conjunto durante la iniciación de la replicación. Esto se descubrió mediante estudios que utilizaron intercambio de imino y espectroscopia de RMN . [ 2 ]

Mamíferos

Se han encontrado DUE en algunos orígenes de replicación de mamíferos hasta la fecha. En general, se han analizado muy pocos orígenes de replicación de mamíferos, por lo que resulta difícil determinar la prevalencia de los DUE en sus orígenes de replicación definidos. [ 5 ]

Las células humanas aún tienen muy poca información sobre sus orígenes. [ 5 ] Se sabe que la replicación se inicia en grandes áreas de zona de iniciación, asociadas con proteínas conocidas como el gen c-myc y el gen de la β-globina . Se cree que las que tienen DUE actúan de forma casi idéntica a las células de levadura. [ 5 ]

El DUE en el origen de los plásmidos en células de mamíferos, SV40 , se encontró asociado con un hexámero T-ag, que introduce superenrollamiento opuesto para aumentar la favorabilidad del desenrollamiento de la cadena. [ 4 ]

Los mamíferos con DUE han mostrado evidencia de capacidades de formación de estructuras que proporcionan estabilidad de cadena simple al ADN desenrollado. Estas incluyen cruciformes , triplex intramoleculares y más. [ 5 ]

Proteínas de unión a DUE

Las proteínas del elemento de desenrollamiento del ADN (DUE-B) se encuentran en eucariotas. [ 3 ]

Actúan para iniciar la separación de la hebra uniéndose a DUE. [ 3 ] Se encontraron homólogos de la secuencia DUE-B entre una variedad de especies animales: peces, anfibios y roedores. [ 3 ] Los DUE-B tienen dominios C-terminales desordenados que se unen a DUE mediante el reconocimiento de este extremo C. [ 3 ] No hay otra especificidad de secuencia involucrada en esta interacción. [ 3 ] Confirmado mediante la inducción de mutaciones a lo largo de la secuencia DUE-B, pero en todos los casos las capacidades de dimerización permanecen intactas. [ 3 ] Al unirse al ADN, el extremo C se ordena, impartiendo una mayor estabilidad contra la degradación por proteasas . [ 3 ] Los DUE-B son 209 residuos en total, 58 de los cuales están desordenados hasta que se unen a DUE. [ 3 ] Los DUE-B hidrolizan ATP para funcionar. [ 3 ] También poseen una secuencia similar a la aminoacil-ARNt sintetasa , y anteriormente fueron clasificados como tal. [ 13 ] Los DUE-B forman homodímeros que crean una estructura secundaria de lámina beta extendida que se extiende a lo largo de ellos. [ 3 ] Dos de estos homodímeros se unen para formar la estructura asimétrica general del DUE-B. [ 3 ]

En la formación del pre-RC, Cdc45 se localiza en el DUE para su actividad a través de la interacción con un DUE-B. [ 11 ] Esto permite el desenrollamiento del dúplex y el inicio de la replicación. [ 11 ]

En humanos, las proteínas DUE-B son 60 aminoácidos más largas que sus homólogas ortólogas en levaduras . [ 13 ] Ambas se localizan principalmente en el núcleo. [ 13 ]

Los niveles de DUE-B se mantienen constantes, independientemente del ciclo celular. [ 13 ] Sin embargo, en la fase S , los DUE-B pueden fosforilarse temporalmente para prevenir la replicación prematura. [ 13 ] La actividad de DUE-B se controla covalentemente. [ 13 ] El ensamblaje de estos DUE-B en las regiones DUE depende de la actividad local de quinasas y fosfatasas . [ 13 ] Los DUE-B también pueden ser regulados negativamente por siRNAs y se han relacionado con la prolongación de las fases G1 . [ 13 ]

Implicaciones de la mutación

Las mutaciones que afectan el desenrollamiento en los sitios DUE impiden directamente la actividad de replicación del ADN. [ 14 ] Esto puede ser resultado de deleciones/cambios en la región DUE, la adición de reactivos o la adición de nucleasa específica . [ 4 ] Sin embargo, los sitios DUE son relativamente insensibles a las mutaciones puntuales , manteniendo su actividad al alterar las bases en los sitios de unión de proteínas. [ 4 ] En muchos casos, la actividad DUE puede recuperarse parcialmente aumentando la temperatura. [ 4 ] También puede recuperarse mediante la reincorporación del sitio DUE. [ 3 ]

Si existe una mutación suficientemente grave en DUE que impide su unión a DUE-B, Cdc45 no puede asociarse ni unirse al factor de transcripción c-myc. Esto puede recuperarse mediante expansiones de longitud (ATTCT)(n) de la secuencia DUE relacionadas con la enfermedad. Si la actividad de DUE se recupera en exceso, podría causar una desregulación en la formación del origen y en la progresión del ciclo celular. [ 11 ]

En eucariotas, cuando se eliminan las DUE-B, la célula no entra en la fase S de su ciclo, donde ocurre la replicación del ADN. Esto provoca un aumento de la apoptosis . [ 3 ] Sin embargo, la actividad puede recuperarse mediante la reintroducción de las DUE-B, incluso de una especie diferente. Esto se debe a que las DUE-B son homólogas entre especies. [ 3 ] Por ejemplo, si las DUE-B en óvulos de Xenopus mutan, no se producirá la replicación del ADN, pero puede recuperarse mediante la adición de DUE-B de células HeLa para restablecer la funcionalidad completa. [ 3 ]

Referencias

  1. 1 2 3 Kowalski D, Eddy MJ (diciembre de 1989). "El elemento de desenrollamiento del ADN: un nuevo componente cis-activo que facilita la apertura del origen de replicación de Escherichia coli" . The EMBO Journal . 8 (13): 4335– 44. doi : 10.1002/j.1460-2075.1989.tb08620.x . PMC 401646. PMID 2556269 .  
  2. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Coman D, Russu IM (mayo de 2005). "Apertura de pares de bases en tres elementos de desenrollamiento de ADN" . The Journal of Biological Chemistry . 280 (21): 20216–21 . doi : 10.1074/jbc.M502773200 . PMID 15784615 . 
  3. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Kemp M, Bae B, Yu JP, Ghosh M, Leffak M, Nair SK (abril de 2007). "Estructura y función de la proteína de unión al elemento desenrollador de ADN c-myc DUE-B" . The Journal of Biological Chemistry . 282 (14): 10441–8 . doi : 10.1074/jbc.M609632200 . PMID 17264083 . 
  4. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 DePamphilis ML (1993). "Replicación del ADN eucariota: anatomía de un origen". Annual Review of Biochemistry . 62 (1): 29– 63. doi : 10.1146/annurev.bi.62.070193.000333 . PMID 8352592 . 
  5. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Potaman VN, Pytlos MJ, Hashem VI, Bissler JJ, Leffak M, Sinden RR (2006). Wells RD, Ashizawa T (eds.). Inestabilidades genéticas y enfermedades neurológicas (Segunda edición). Burlington: Academic Press. págs. 447–460 . doi : 10.1016/B978-012369462-1/50031-4 . ISBN   9780123694621.
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  11. 1 2 3 4 Chowdhury A, Liu G, Kemp M, Chen X, Katrangi N, Myers S, Ghosh M, Yao J, Gao Y, Bubulya P, Leffak M (marzo de 2010). "La proteína de unión al elemento de desenrollamiento del ADN DUE-B interactúa con Cdc45 en la formación del complejo de preiniciación" . Biología molecular y celular . 30 (6): 1495– 507. doi : 10.1128/MCB.00710-09 . PMC 2832489. PMID 20065034 .  
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