Delitto perfetto

Delitto perfetto ( en italiano: [ deˈlitto perˈfɛtto ] ) es una técnica genética para la mutagénesis dirigida in vivo en levaduras. Este nombre es el término italiano para "asesinato perfecto" y hace referencia a la capacidad de la técnica para crear los cambios genéticos deseados sin dejar ADN extraño en el genoma .

Fondo

Esta técnica fue desarrollada por un grupo del Instituto Nacional de Ciencias de la Salud Ambiental (NIEHS), integrado por Michael A. Resnick, Francesca Storici (actualmente en el Instituto Tecnológico de Georgia) y L. Kevin Lewis (actualmente en la Universidad Estatal del Suroeste de Texas). El método utiliza oligonucleótidos sintéticos en combinación con el proceso celular de recombinación homóloga . Por consiguiente, resulta idóneo para la manipulación genética de la levadura, que posee una recombinación homóloga altamente eficiente. El método delitto perfetto se ha utilizado para producir mutaciones puntuales simples y múltiples, truncamientos o inserciones de genes y deleciones de genes completos (incluidos genes esenciales).

Ventajas

La principal ventaja de esta técnica radica en su capacidad para eliminar cualquier ADN extraño del genoma tras el proceso de mutagénesis. Esto garantiza que no queden marcadores seleccionables ni secuencias exógenas utilizadas para la selección en el genoma que puedan causar efectos imprevistos.

La técnica delitto perfetto también es más sencilla en comparación con otros métodos de mutagénesis dirigida in vivo . Otros métodos requieren múltiples pasos de clonación y una extensa secuenciación de ADN para confirmar la mutagénesis, lo que suele ser un proceso complicado e ineficiente. ^{[ 1 ]}^{[ 2 ]}^{[ 3 ]}

Este método ofrece una gran flexibilidad, ya que, una vez insertado el casete CORE (véase la descripción general del método para más detalles), se pueden realizar múltiples mutaciones en el gen de interés de forma fácil y rápida.

Este método puede aplicarse a otros organismos donde la recombinación homóloga es eficiente, como el musgo Physcomitrella patens , las células de pollo DT40 o E. coli . Además, los genes humanos pueden estudiarse y manipularse genéticamente de forma similar en levaduras mediante el uso de cromosomas artificiales de levadura (YAC).

Desventajas

Dado que la técnica delitto perfetto se basa en la recombinación homóloga, este proceso debe ser funcional en las células para que la técnica funcione. En Saccharomyces cerevisiae , el gen RAD52 es esencial para la recombinación homóloga y, por lo tanto, es necesario para el método delitto perfetto .

Este método solo resulta útil en aplicaciones donde no se requieren marcadores seleccionables. Por ejemplo, las cepas de levadura mutagenizadas no pueden utilizarse para análisis genéticos posteriores, como el análisis de tétradas. En estos casos, sería necesario insertar marcadores en el locus correspondiente mediante un proceso aparte.

Inconvenientes técnicos

Costo de los oligonucleótidos
La mutagénesis se limita a la región del genoma que rodea el casete insertado.
Número limitado de genes reporteros (restringido por los casetes CORE disponibles)
Baja eficiencia para ciertas aplicaciones (por ejemplo, la eliminación de genes esenciales).

Descripción general del método

Delitto Perfetto es un método de dos pasos para la mutagénesis in vivo . En el primer paso, el casete CORE se inserta en la región de interés mediante recombinación homóloga. Posteriormente, el casete CORE se reemplaza con ADN que contiene la mutación de interés.

casetes CORE

El casete CORE contiene un marcador no seleccionable CO y un gen reportero RE . El gen reportero permite seleccionar las células de levadura que reciben el casete CORE durante la primera etapa del proceso. El marcador no seleccionable permite seleccionar las células de levadura que pierden el casete CORE mediante la integración del oligonucleótido mutado durante la segunda etapa del proceso.

Hay una variedad de casetes CORE para elegir, que contienen una variedad de genes reporteros, marcadores contraseleccionables y características adicionales. ^{[ 4 ]}

Genes reporteros

kanMX4 : permite el crecimiento en medios que contienen Geneticina
hyg – permite el crecimiento en medios que contienen higromicina B.

Marcadores seleccionables en contra

Kl URA3 : previene el crecimiento en medios que contienen ácido 5-fluoroorótico.
GAL1/10 -p53 – previene el crecimiento en medios que contienen galactosa . Codifica un mutante tóxico de p53 bajo el promotor GAL1 . ^{[ 5 ]}

Características adicionales

GAL1 -I- Sce I – Aumenta la eficiencia de la localización en el cromosoma que contiene el casete CORE en células diploides. Contiene la endonucleasa de restricción SceI bajo el promotor GAL1 y la secuencia diana de SceI. ^{[ 6 ]}^{[ 7 ]}

Flujo de trabajo de la técnica

Primero, el casete CORE se amplifica mediante PCR con cebadores que contienen regiones homólogas al sitio cromosómico donde se insertará. El casete CORE se integra mediante recombinación homóloga. Las células que contienen el casete CORE se pueden seleccionar para usar el gen reportero y se pueden confirmar posteriormente usando el marcador de contraselección. La integración del casete CORE en la ubicación cromosómica correcta se puede verificar mediante PCR usando cebadores que se unen aguas arriba del sitio de integración, dentro del CORE y aguas abajo del tamaño de integración, diseñados para generar fragmentos de 500 a 1500 pb. ^{[ 4 ]}

Las células de levadura que contienen el casete CORE se transforman con oligonucleótidos que contienen la mutación deseada, de manera que provocan la pérdida del casete CORE durante la recombinación homóloga. Los transformantes se seleccionan mediante el marcador de contraselección y se pueden analizar posteriormente con el gen reportero. La secuenciación se utiliza para asegurar que se ha generado la mutación correcta sin mutaciones adicionales. Alternativamente, si la mutación produce la generación o pérdida de un sitio de restricción , se puede utilizar la PCR seguida de digestión con enzimas de restricción para confirmar que la mutación deseada se ha integrado. ^{[ 4 ]}

Delitto perfetto mediado por rotura de doble hebra (DSB)

Para aumentar la especificidad de los oligonucleótidos para el casete CORE, se pueden utilizar casetes CORE que contengan la característica GAL1 -I- SceI . Esta característica permite la expresión de SceI, una endonucleasa que reconoce una secuencia de 18 nucleótidos altamente única, difícilmente presente en cualquier otro lugar del genoma de S. cerevisiae . La endonucleasa SceI es capaz de generar una rotura de doble cadena (DSB) en el sitio SceI, lo que conduce al reclutamiento de la maquinaria de reparación del ADN . ^{[ 8 ]} Esto aumenta la frecuencia de recombinación homóloga dirigida en 4000 veces en comparación con cuando no se genera ninguna DSB. ^{[ 6 ]}

Consideraciones generales para el diseño de oligonucleótidos

Se pueden generar oligonucleótidos de 80 a 100 pares de bases como moléculas individuales o pares de oligonucleótidos que se superponen total o parcialmente. El tipo de oligonucleótido recomendado depende del tipo de mutación y de la distancia a la que se desea introducirla desde el sitio de integración del casete CORE.

Los oligonucleótidos más largos conducen a una mayor eficiencia de transformación . Los pares de oligonucleótidos totalmente complementarios producen un aumento de 5 a 10 veces en la eficiencia en comparación con los oligonucleótidos individuales y se recomiendan para todas las aplicaciones. ^{[ 4 ]}^{[ 9 ]} Sin embargo, proporcionan una pequeña ventana de mutagénesis de solo 20 a 40 bases desde el casete CORE. Para aumentar la ventana de mutagénesis, se pueden usar pares de oligonucleótidos con una superposición de 20 pb, y estos permiten dirigir hasta 100 pb aguas arriba y aguas abajo del sitio de integración CORE. Sin embargo, transforman aproximadamente 6 veces menos eficientemente. Para aumentar la eficiencia, los oligonucleótidos parcialmente superpuestos se pueden extender in vitro . ^{[ 9 ]}

Para deleciones genéticas

Se diseñan oligonucleótidos que contienen la secuencia aguas arriba seguida inmediatamente por la secuencia aguas abajo de la región que se va a eliminar. Para las deleciones génicas, los pares de oligonucleótidos de 80 a 100 pb que se solapan completamente dan lugar a un aumento de 5 a 10 veces en la eficiencia de transformación en comparación con los oligonucleótidos individuales. ^{[ 4 ]}

Para mutaciones puntuales

Para mutaciones de 20 a 40 pb del casete CORE, se recomiendan oligonucleótidos de solapamiento completo de 80 a 100 pb. Para mutaciones de más de 40 pb del casete CORE, deben utilizarse oligonucleótidos de solapamiento parcial. Para aumentar su eficiencia de transformación, se recomienda extender in vitro los oligonucleótidos de solapamiento parcial . ^{[ 4 ]}^{[ 6 ]}^{[ 9 ]}

Para genes esenciales

Para generar mutantes de genes esenciales, se puede insertar el casete CORE corriente abajo del gen de interés; sin embargo, esto limita las regiones del gen disponibles para la mutación. Como alternativa, se pueden usar células diploides. No obstante, el uso de células diploides disminuye la eficiencia de la focalización de oligonucleótidos debido a la presencia de dos ubicaciones cromosómicas adecuadas para la recombinación de los oligonucleótidos. Para solucionar este inconveniente, se puede utilizar el método delitto perfetto mediado por DSB. Este método aumenta la frecuencia de recombinación homóloga dirigida en 700 veces en comparación con cuando no se genera ningún DSB. Además, es de 2 a 5 veces más eficiente que otros métodos disponibles. ^{[ 6 ]}^{[ 9 ]}

Tasas de mutación de fondo

Se informa que cuando no se generan rupturas de doble cadena, el número de células que pierden el casete CORE en ausencia de un oligonucleótido de direccionamiento es menor a un transformante por cada 10⁷ ^células viables. Por el contrario, este número aumenta hasta 100 transformantes por cada 10⁷ ^células viables cuando se genera una ruptura de doble cadena. En un organismo diploide, el aumento de las tasas de mutación de fondo se produce debido a la recombinación homóloga con el cromosoma homólogo, lo que reduce los eventos de transformación dirigida a solo el 4% del total de transformantes. ^{[ 6 ]}

Referencias

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