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La prueba de difusión en disco (también conocida como prueba de difusión en agar , prueba de Kirby - Bauer , prueba de susceptibilidad a antibióticos por difusión en disco , prueba de sensibilidad a antibióticos por difusión en disco y prueba KB ) es un ensayo microbiológico basado en cultivos que se utiliza en laboratorios de diagnóstico y descubrimiento de fármacos . En los laboratorios de diagnóstico, el ensayo se utiliza para determinar la susceptibilidad de las bacterias aisladas de la infección de un paciente a los antibióticos clínicamente aprobados. Esto permite a los médicos prescribir el tratamiento antibiótico más adecuado. [ 1 ] [ 2 ] [ 4 ] [ 5 ] En los laboratorios de descubrimiento de fármacos, especialmente en los de bioprospección , el ensayo se utiliza para examinar material biológico (por ejemplo, extractos de plantas, caldos de fermentación bacteriana) y candidatos a fármacos para detectar actividad antibacteriana. En la bioprospección, el ensayo se puede realizar con cepas bacterianas emparejadas para lograr la desreplicación e identificar provisionalmente el mecanismo de acción antibacteriano . [ 6 ] [ 7 ]
En los laboratorios de diagnóstico, la prueba se realiza inoculando la superficie de una placa de agar con bacterias aisladas de la infección de un paciente. A continuación, se aplican discos de papel con antibióticos al agar y se incuba la placa. Si un antibiótico detiene el crecimiento bacteriano o mata las bacterias , se formará una zona alrededor del disco donde las bacterias no han crecido lo suficiente como para ser visibles. Esto se denomina zona de inhibición. La susceptibilidad del aislado bacteriano a cada antibiótico se puede cuantificar semicuantitativamente comparando el tamaño de estas zonas de inhibición con bases de datos de información sobre bacterias conocidas sensibles, moderadamente sensibles y resistentes a los antibióticos. De esta forma, es posible identificar el antibiótico más adecuado para tratar la infección de un paciente. [ 1 ] [ 2 ] Aunque la prueba de difusión en disco no permite diferenciar la actividad bacteriostática de la bactericida, es menos engorrosa que otros métodos de prueba de susceptibilidad, como la dilución en caldo . [ 4 ]
En los laboratorios de descubrimiento de fármacos, la prueba de difusión en disco se realiza de forma ligeramente diferente a como se hace en los laboratorios de diagnóstico. En este contexto, no es la cepa bacteriana la que debe caracterizarse, sino un extracto de prueba (por ejemplo, un extracto vegetal o microbiano). Por lo tanto, la placa de agar se inocula con una cepa bacteriana de fenotipo conocido (a menudo una cepa ATCC o NCTC ), y se aplican discos que contienen el extracto de prueba a la superficie (véase más abajo ). [ 6 ] El tamaño de la zona de inhibición no puede utilizarse como una medida semicuantitativa de la potencia antibacteriana porque los diferentes extractos contienen moléculas con diferentes características de difusión (diferentes tamaños moleculares , hidrofilicidad , etc.). Sin embargo, el tamaño de la zona de inhibición puede utilizarse para la desreplicación. Esto se logra probando cada extracto frente a cepas bacterianas emparejadas (por ejemplo, cepas sensibles y resistentes a la estreptomicina para identificar extractos que contienen estreptomicina). Las cepas emparejadas (por ejemplo, cepas de tipo salvaje y cepas que sobreexpresan el objetivo ) también pueden utilizarse para identificar el mecanismo de acción antibacteriano. [ 6 ] [ 7 ]
Historia
La difusión en agar fue utilizada por primera vez por Martinus Beijerinck en 1889 para estudiar el efecto de las auxinas en el crecimiento bacteriano. Sin embargo, el método ha sido desarrollado, perfeccionado y estandarizado por muchos científicos y organizaciones científicas a lo largo de los años, incluyendo a George F. Reddish, Norman Heatley , James G. Vincent, [ 8 ] Alfred W. Bauer, William MM Kirby, John C. Sherris , [ 4 ] [ 5 ] Hans Martin Ericsson, la Organización Mundial de la Salud , el Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio , el Grupo de Referencia Sueco para Antibióticos, el Instituto Alemán de Normalización , la Sociedad Británica de Quimioterapia Antimicrobiana y otros. [ 8 ]
Principio
Un cultivo bacteriano puro se suspende en solución salina, se estandariza su turbidez y se extiende uniformemente sobre una placa de agar. A continuación, se coloca un disco de papel de filtro impregnado con antibiótico o extracto sobre la superficie del agar. Los componentes del disco se difunden desde el papel de filtro hacia el agar. La concentración de estos componentes será máxima cerca del disco y disminuirá a medida que aumente la distancia. Si el antibiótico o extracto es eficaz contra las bacterias a una concentración determinada, no crecerán colonias donde la concentración en el agar sea mayor o igual a la concentración efectiva. Esta es la zona de inhibición. En general, las zonas de inhibición más grandes se correlacionan con concentraciones mínimas inhibitorias (CMI) más bajas del antibiótico o extracto para esa cepa bacteriana. [ 1 ] Una excepción a esto se da cuando las moléculas del antibiótico o extracto son grandes o hidrofóbicas, ya que estas se difunden lentamente a través del agar. [ 6 ]
Método estándar
Preparación de placas de agar e inóculo
Todos los aspectos del procedimiento de Kirby-Bauer están estandarizados para garantizar resultados consistentes y precisos. Por ello, un laboratorio debe cumplir con estos estándares. El medio utilizado en la prueba de Kirby - Bauer debe ser agar Mueller-Hinton con una profundidad de solo 4 mm, vertido en placas de Petri de 100 mm o 150 mm. El pH del agar debe estar entre 7,2 y 7,4. El inóculo bacteriano se prepara diluyendo un cultivo en caldo hasta alcanzar un estándar de turbidez de 0,5 McFarland , que equivale a aproximadamente 150 millones de células por mL. [ 1 ]
Inoculación e incubación
Utilizando una técnica aséptica , se toma una muestra de cultivo en caldo de un organismo específico con un hisopo estéril . En el caso de bacterias Gram negativas , se elimina el exceso de líquido del hisopo presionándolo o girándolo suavemente contra el interior del tubo. A continuación, el hisopo se extiende sobre una placa de agar Mueller-Hinton para formar una capa bacteriana. Para obtener un crecimiento uniforme, se extiende la placa de agar con el hisopo en una dirección, se gira 120° y se extiende de nuevo, se gira otros 120° y se extiende una vez más. Utilizando un dispensador de discos de antibióticos, se aplican a la placa discos que contienen antibióticos específicos. Esto debe hacerse dentro de los 15 minutos posteriores a la inoculación. Se utilizan pinzas esterilizadas a la llama para presionar suavemente cada disco sobre el agar y asegurar su adhesión. Las placas se incuban durante la noche, generalmente a una temperatura de 35 °C. Las placas deben incubarse dentro de los 15 minutos posteriores a la aplicación de los discos de antibióticos. [ 1 ]
Modificaciones de los medios de prueba
Ciertas bacterias requieren la adición de una solución al 5 % de sangre de caballo desfibrinada mecánicamente y β-NAD (agar MH-F). [ 1 ] La siguiente tabla muestra los requerimientos de medios de cultivo de los microorganismos comúnmente analizados:
Control de calidad
Para garantizar la veracidad de los resultados de las pruebas, deben utilizarse métodos de control de calidad . Con el fin de supervisar el rendimiento de la prueba, se utilizan cepas bacterianas especiales como control positivo o negativo. Cuando se evalúa la eficacia de la β-lactamasa, se utilizan cepas especiales que presentan resistencia a los β-lactámicos. Además, se utilizan medios específicos para probar ciertos antibióticos. Por ejemplo, al probar la susceptibilidad al cotrimoxazol , se recomiendan medios con exceso de timina y timidina . [ 1 ] La siguiente tabla enumera las cepas de control de calidad comúnmente utilizadas en el método de difusión en disco:
Métodos alternativos
Se han desarrollado varias variantes del método de difusión en disco, incluyendo los métodos de copa de penicilina de Oxford y Etest utilizados en laboratorios de diagnóstico hospitalarios, [ 28 ] [ 29 ] y los métodos de difusión en pozo, difusión en cilindro y bioautografía utilizados en laboratorios de descubrimiento y desarrollo de fármacos. [ 6 ] [ 30 ]
Método de la copa de penicilina de Oxford
Se colocan discos con concentraciones crecientes de antibióticos sobre un cultivo bacteriano sembrado en la superficie del agar y se incuban las placas. El tamaño de las zonas se mide desde el borde del disco hasta el final de la zona clara. La interpretación es más compleja en poblaciones con susceptibilidad mixta. Estas se representan gráficamente como dimensiones lineales o cuadrados de distancias en función del logaritmo natural de la concentración de antibiótico en los discos. La CMI se determina a partir de la intersección cero de un ajuste de regresión lineal a través de los datos. [ 31 ] La intersección es el logaritmo de la CMI. La pendiente de la línea de regresión está relacionada con el coeficiente de difusión de ese antibiótico en particular en el agar. [ 28 ]
Prueba rápida de sensibilidad a los antibióticos (RAST) de EUCAST
El método RAST sirve como una forma rápida de determinar la susceptibilidad a los antibióticos y fue creado como una modificación de la prueba clásica de difusión en disco. Permite acortar el tiempo de incubación a 16-20 horas. Los resultados de la prueba se leen después de 4, 6, 8 y 16-20 horas. En comparación con el método estándar, RAST no proporciona zonas de inhibición bien definidas en un lapso de tiempo tan corto (todas las bacterias, excepto S. pneumoniae, tienen una probabilidad de lectura superior al 90% después de 6 horas). En cuanto a las cepas de control de calidad, se diluyen 1:1 000 000 y se les añade sangre de caballo u oveja desfibrinada. Se deben utilizar tablas de puntos de corte RAST especiales al interpretar los resultados debido a las diferencias en la calibración del método. [ 32 ]
Las cepas de control de calidad validadas incluyen: E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853, S. aureus ATCC 29213, E. faecalis ATCC 29212, S. pneumoniae ATCC 49619. [ 33 ]
Detección de mecanismos de resistencia a los antibióticos en RAST
RAST permite la determinación rápida de la posible resistencia a los antibióticos en los cultivos analizados. Permite comprobar la presencia de E. coli y K. pneumoniae productoras de ESBL y/o carbapenemasas, utilizando cefotaxima/ceftazidima (después de 4 horas) y meropenem (después de 6 horas), respectivamente. Sin embargo, estos resultados no son cuantitativos y deben utilizarse únicamente para la detección en pruebas médicas de rutina. [ 34 ] [ 35 ] En ensayos clínicos, el método RAST condujo a mejoras significativas en la predicción de la eficacia de la terapia antibiótica. [ 36 ]
Método de predifusión de disco
Se colocan discos que contienen antibióticos sobre una placa de agar Mueller-Hinton sin inocular y se incuban durante 2 horas. Luego, se retiran y se aplica la suspensión bacteriana previamente preparada mediante microdilución en caldo. Se coloca otro disco con un antibiótico diferente exactamente en el mismo lugar que el anterior. Tras una incubación de 16 a 20 horas, los resultados se correlacionan con los valores de CMI del primer antibiótico. Un ejemplo del método de predifusión es la prueba de la eficacia in vitro de ceftazidima/avibactam (discos primarios) en comparación con aztreonam (discos secundarios). [ 37 ]
Pruebas de medicamentos antimicóticos
El método de difusión en disco puede utilizarse para evaluar la susceptibilidad a los antifúngicos. [ 38 ] [ 39 ]
Bioautografía
En comparación con los métodos clásicos basados en discos, la bioautografía utiliza cromatografía de capa fina para separar los componentes de la mezcla analizada. Luego, la placa de TLC se puede colocar sobre el agar inoculado y dejar que se difunda en él ( bioautografía de contacto ) o cubrirse con un caldo que contenga microorganismos ( bioautografía directa ). A continuación, la muestra se incuba y se miden las zonas de inhibición. [ 41 ] [ 42 ] [ 40 ] Alternativamente, la placa de TLC se puede cubrir con agar fundido en la bioautografía de superposición de agar . [ 43 ]
Para visualizar zonas de inhibición en la bioautografía directa, se utilizan reactivos que detectan la actividad de la deshidrogenasa (por ejemplo, sales de tetrazolio , que son convertidas por las deshidrogenasas microbianas en formazanos cromogénicos ). [ 41 ]
Otras imágenes
La difusión en agar fue utilizada por primera vez en 1889 por Martinus Beijerinck . [ 8 ]
Un vistazo de cerca a los resultados de una prueba de difusión en agar.
Antibiograma de Serratia marcescens . Cada disco está etiquetado con el antibiótico que contiene (por ejemplo, AMC30, 30 μg de amoxicilina/ácido clavulánico ).
Lector automático de placas de cultivo para medir los diámetros de las zonas de inhibición.
Véase también
Referencias
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Notas
- ^ Klebsiella quasipneumoniae Brisse et al.
- Técnicas de microbiología
- Resistencia antimicrobiana
