Ensayo de desplazamiento de la movilidad electroforética

Un ensayo de desplazamiento de movilidad electroforética (EMSA) o electroforesis de desplazamiento de movilidad , también conocido como ensayo de desplazamiento en gel , ensayo de desplazamiento de movilidad en gel , ensayo de desplazamiento de banda o ensayo de retardo en gel , es una técnica común de electroforesis de afinidad utilizada para estudiar las interacciones proteína-ADN o proteína - ARN . Este procedimiento puede determinar si una proteína o mezcla de proteínas es capaz de unirse a una secuencia de ADN o ARN determinada, y a veces puede indicar si más de una molécula de proteína está involucrada en el complejo de unión. Los ensayos de desplazamiento en gel se realizan a menudo in vitro simultáneamente con experimentos de huella de ADNasa , extensión de cebadores y sondas de promotores cuando se estudian la iniciación de la transcripción , la replicación en grupo del ADN, la reparación del ADN o el procesamiento y maduración del ARN, así como el empalme del pre-ARNm. ^{[ 1 ]} Aunque se pueden encontrar precursores en la literatura anterior, la mayoría de los ensayos actuales se basan en métodos descritos por Garner y Revzin ^{[ 2 ]} y Fried y Crothers . ^{[ 3 ]}

Un ensayo de desplazamiento de movilidad es una separación electroforética de una mezcla de proteína-ADN o proteína-ARN en un gel de poliacrilamida o agarosa durante un período corto (aproximadamente 1,5-2 h para un gel de 15 a 20 cm). ^{[ 4 ]} La velocidad a la que diferentes moléculas (y combinaciones de las mismas) se mueven a través del gel está determinada por su tamaño y carga, y en menor medida, por su forma (véase electroforesis en gel ). El carril de control (sonda de ADN sin proteína presente) contendrá una sola banda correspondiente al fragmento de ADN o ARN no unido. Sin embargo, suponiendo que la proteína sea capaz de unirse al fragmento, el carril con una proteína que se une presente contendrá otra banda que representa el complejo más grande y menos móvil de la sonda de ácido nucleico unida a la proteína que se ha "desplazado" hacia arriba en el gel (ya que se ha movido más lentamente).

Bajo las condiciones experimentales correctas, la interacción entre el ADN (o ARN) y la proteína se estabiliza y la proporción de ácido nucleico unido a no unido en el gel refleja la fracción de moléculas de sonda libres y unidas a medida que la reacción de unión entra en el gel. Esta estabilidad se debe en parte a un "efecto de jaula", ya que la proteína, rodeada por la matriz del gel, no puede difundirse lejos de la sonda antes de que se recombinen. ^{[ 5 ]} Si se conocen las concentraciones iniciales de proteína y sonda, y si se conoce la estequiometría del complejo, se puede determinar la afinidad aparente de la proteína por la secuencia de ácido nucleico. ^{[ 6 ]} A menos que el complejo sea muy estable en condiciones de gel, o que se tenga en cuenta la disociación durante la electroforesis, el número derivado es una Kd aparente. Si no se conoce la concentración de proteína pero sí la estequiometría del complejo, la concentración de proteína se puede determinar aumentando la concentración de la sonda de ADN hasta que incrementos adicionales no aumenten la fracción de proteína unida. Mediante la comparación con un conjunto de diluciones estándar de sonda libre analizadas en el mismo gel, se puede calcular el número de moles de proteína. ^{[ 4 ]}

Se puede añadir a esta mezcla un anticuerpo que reconozca la proteína para crear un complejo aún mayor con un desplazamiento más pronunciado. Este método se denomina ensayo de superdesplazamiento y se utiliza para identificar de forma inequívoca una proteína presente en el complejo proteína-ácido nucleico.

A menudo, se utiliza una calle adicional con un oligonucleótido competidor para determinar la secuencia de unión más favorable para la proteína de unión. El uso de diferentes oligonucleótidos de secuencia definida permite identificar el sitio de unión preciso mediante competencia (no se muestra en el diagrama). Las variantes del ensayo de competencia son útiles para medir la especificidad de la unión y la cinética de asociación y disociación. Por lo tanto, EMSA también podría utilizarse como parte de un experimento SELEX para seleccionar oligonucleótidos que realmente se unan a una proteína determinada.

Una vez determinada la unión ADN-proteína in vitro , varios algoritmos pueden acotar la búsqueda para la identificación del factor de transcripción. Los oligonucleótidos de secuencia consenso para el factor de transcripción de interés podrán competir por la unión, eliminando la banda desplazada, y deben confirmarse mediante supershift. Si la secuencia consenso predicha no compite por la unión, la identificación del factor de transcripción puede facilitarse mediante EMSA de competidor multiplexado (MC-EMSA), en la que se multiplexan grandes conjuntos de secuencias consenso en cada reacción, y cuando un conjunto compite por la unión, las secuencias consenso individuales de este conjunto se procesan en una reacción adicional. ^{[ 7 ]}

Para fines de visualización, el fragmento de ácido nucleico generalmente se marca con un marcador radiactivo , fluorescente o de biotina . La tinción estándar con bromuro de etidio es menos sensible que estos métodos y puede carecer de la sensibilidad para detectar el ácido nucleico si se utilizan pequeñas cantidades de ácido nucleico o ácidos nucleicos monocatenarios en estos experimentos. Cuando se utiliza un marcador de biotina, se utiliza estreptavidina conjugada a una enzima como la peroxidasa de rábano picante para detectar el fragmento de ADN. ^{[ 8 ] [ 9 ]} Si bien el marcaje isotópico del ADN tiene poco o ningún efecto sobre la afinidad de unión de la proteína, el uso de marcadores no isotópicos, incluidos fluoróforos o biotina, puede alterar la afinidad y/o la estequiometría de la interacción proteica de interés. La competencia entre una sonda marcada con fluoróforo o biotina y ADN no marcado de la misma secuencia puede utilizarse para determinar si el marcador altera la afinidad de unión o la estequiometría.

• Protocolo de desplazamiento de gel quimioluminiscente