Perfilado de secuencias finales

El perfilado de secuencias finales (ESP) (a veces denominado "mapeo de extremos emparejados (PEM)") es un método basado en conectores marcados con secuencias, desarrollado para facilitar la secuenciación de novo del genoma y para identificar aberraciones estructurales y del número de copias de alta resolución, como inversiones y translocaciones .

En resumen, el ADN genómico objetivo se aísla y se digiere parcialmente con enzimas de restricción para obtener fragmentos grandes. Tras la separación por tamaño, los fragmentos se clonan en plásmidos para construir cromosomas artificiales, como los cromosomas artificiales bacterianos (BAC), que posteriormente se secuencian y se comparan con el genoma de referencia . Las diferencias, incluidas las variaciones de orientación y longitud entre los cromosomas construidos y el genoma de referencia, indicarán aberraciones estructurales y en el número de copias.

Antes de analizar la aberración estructural del genoma objetivo y la variación del número de copias (CNV) con ESP, el genoma objetivo se suele amplificar y conservar mediante la construcción de cromosomas artificiales. La estrategia clásica para construir un cromosoma artificial es el cromosoma artificial bacteriano (BAC). Básicamente, el cromosoma objetivo se digiere aleatoriamente y se inserta en plásmidos que se transforman y clonan en bacterias. ^{[ 1 ]} El tamaño de los fragmentos insertados es de 150–350 kb. ^{[ 2 ]} Otro cromosoma artificial de uso común es el fosmido. La diferencia entre BAC y fosmidos es el tamaño del ADN insertado. Los fosmidos solo pueden contener fragmentos de ADN de 40 kb, ^{[ 3 ]} lo que permite una determinación más precisa del punto de ruptura.

El perfilado de secuencias de extremos (ESP) puede utilizarse para detectar variaciones estructurales como inserciones, deleciones y reordenamientos cromosómicos . En comparación con otros métodos que analizan anomalías cromosómicas, el ESP es particularmente útil para identificar anomalías sin cambio en el número de copias, como inversiones y translocaciones, que no serían evidentes al analizar la variación del número de copias. ^{[ 4 ] [ 5 ]} A partir de la biblioteca BAC, ambos extremos de los fragmentos insertados se secuencian utilizando una plataforma de secuenciación. La detección de variaciones se logra mapeando las lecturas secuenciadas sobre un genoma de referencia.

Inversión y translocación

Las inversiones y translocaciones son relativamente fáciles de detectar mediante un par de extremos secuenciados inválidos. Por ejemplo, una translocación puede detectarse si los extremos emparejados se mapean en cromosomas diferentes en el genoma de referencia. ^{[ 4 ] [ 5 ]} La inversión puede detectarse mediante la orientación divergente de las lecturas, donde el inserto tendrá dos extremos positivos o dos extremos negativos.

Variación del número de copias

En algunos casos, las lecturas discordantes también pueden indicar una variación en el número de copias (CNV) , por ejemplo, en secuencias repetidas. Para CNV de mayor tamaño, la densidad de las lecturas variará en función del número de copias. Un aumento en el número de copias se reflejará en un mapeo más extenso de la misma región en el genoma de referencia.

ESP fue desarrollado y publicado por primera vez en 2003 por el Dr. Collins y sus colegas en la Universidad de California, San Francisco. Su estudio reveló los reordenamientos cromosómicos y las CNV de las células cancerosas humanas MCF7 con una resolución de 150 kb, mucho más precisa que la CGH y el cariotipado espectral de la época. ^{[ 5 ]} En 2007, el Dr. Snyder y su grupo mejoraron ESP a una resolución de 3 kb mediante la secuenciación de ambos pares de fragmentos de ADN de 3 kb sin la construcción de BAC. Su método permite identificar deleciones, inversiones e inserciones con una resolución promedio de punto de ruptura de 644 pb, cercana a la resolución de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). ^{[ 7 ]}

Se pueden utilizar diversas herramientas bioinformáticas para analizar el perfilado de secuencias terminales. Algunas comunes incluyen BreakDancer, PEMer, Variation Hunter, LAW común, GASV y Spanner. ^{[ 8 ]} ESP se puede utilizar para mapear la variación estructural a alta resolución en tejido enfermo. Esta técnica se utiliza principalmente en muestras tumorales de diferentes tipos de cáncer. La identificación precisa de anomalías cromosómicas con número de copias neutro es particularmente importante, ya que la translocación puede conducir a proteínas de fusión, proteínas quiméricas o proteínas desreguladas que pueden observarse en tumores. Esta técnica también se puede utilizar en estudios de evolución al identificar grandes variaciones estructurales entre diferentes poblaciones. ^{[ 9 ]} Se están desarrollando métodos similares para diversas aplicaciones. Por ejemplo, se utilizó un enfoque de secuenciación de extremos emparejados de Illumina con código de barras (BIPES) para evaluar la diversidad microbiana mediante la secuenciación de la etiqueta 16S V6. ^{[ 10 ]}

La resolución de la detección de variaciones estructurales mediante ESP se ha incrementado hasta alcanzar un nivel similar al de la PCR, y puede mejorarse aún más mediante la selección de fragmentos de ADN de tamaño más uniforme. ESP puede aplicarse con o sin cromosomas artificiales construidos. Con BAC, se pueden inmortalizar y conservar muestras valiosas, lo cual es particularmente importante para pequeñas cantidades de muestras destinadas a análisis exhaustivos. Además, los BAC que contienen fragmentos de ADN reordenados pueden transfectarse directamente in vitro o in vivo para analizar la función de estos reordenamientos. Sin embargo, la construcción de BAC sigue siendo costosa y laboriosa. Los investigadores deben ser muy cuidadosos al elegir la estrategia adecuada para cada proyecto. Dado que ESP solo analiza secuencias cortas de extremos apareados, tiene la ventaja de proporcionar información útil a nivel genómico sin necesidad de secuenciación a gran escala. Sin embargo, ESP depende del mapeo único de lecturas de extremos apareados a un genoma de referencia, por lo que las variantes estructurales en regiones repetitivas o de baja complejidad, incluidas las duplicaciones segmentarias, pueden ser más difíciles de detectar de forma fiable. ^{[ 11 ] [ 12 ]} Aproximadamente 100-200 tumores pueden ser secuenciados con una resolución mayor a 150 kb en comparación con la secuenciación de un genoma completo.

• anomalías cromosómicas
• Inversión cromosómica
• Inserción (genética)
• Eliminación (genética)
• Translocación cromosómica
• Anomalía cromosómica
• Variación del número de copias