Enniatin

La enniatina B es una molécula simétrica con tres componentes de N-metil-L- valina y tres de α-hidroxi-D- isovalérico . Esta estructura conduce a la diamerización y, por lo tanto, a la generación de ionóforos, que pueden transportar iones a través de las membranas, influyendo específicamente en el funcionamiento mitocondrial. ^{[ 8 ]}

Nombre IUPAC: (3 S ,6 R ,9 S ,12 R ,15 S ,18 R )-4,10,16-trimetil-3,6,9,12,15,18-hexa(propan-2-il)-1,7,13-trioxa-4,10,16-triazaciclooctadecano-2,5,8,11,14,17-hexona. ^{[ 13 ]}

La síntesis previa de enniatina B incluía reacciones de Mitsanobu mediadas por PCl5 y HBr _, que forman un éster a partir de un alcohol, con una posterior trimetilación de amida mediada por plata . ^{[ 14 ] [ 15 ] [ 16 ]}  

Debido a la precipitación en las secuencias de reacción, se propuso otro modo de síntesis de (−)-enniatina B a partir del ácido (2R ) -2-hidroxi-3-metilbutanoico. Estos nueve pasos, que se han descrito para lograr un rendimiento del 15%, prometen una mayor idoneidad en cuanto a precipitados y pasos de purificación intermedios más sencillos. ^{[ 15 ]}  

El paso (a) comprende la reacción del ácido (8) con el alcohol (7) con los reactivos EDCI y DMAP (4-dimetilaminopiridina, 1,3 equivalentes) y diclorometano al 82%. El DMAP es útil para reducir la formación de anhídrido .   ^{[ 15 ]}

El depsipeptidato resultante reacciona para lograr la hidrogenólisis y la desprotección catalizada por ácido con (b) H₂ _, Pd/C, EtOAc (100%) y (c) HCl 4 M/1,4-dioxano (100%), respectivamente, lo que produce un ácido (10) y una sal de amina (11).   ^{[ 15 ]}

Estos se acoplan con el reactivo de Ghosez (d) (1-cloro-N,N,2-trimetil-1-propenilamina) y DIPEA (diisopropiletilamina) con diclorometano.   ^{[ 15 ]}

Sobre este compuesto acoplado, el tetradepsipéptido, se realizó hidrogenólisis y otro acoplamiento a un segundo equivalente de la sal de amina 11 para obtener el hexadepsipéptido (13) con los reactivos (e) H2, Pd/C, EtOAc (100%) y (f) reactivo de Ghosez, DIPEA y diclorometano.   ^{[ 15 ]}

El hexapesíptido (13) puede desprotegerse mediante hidrogenólisis como en (g) H2, Pd/C, EtOAc (88%) y acidificación con (h) 4 M HCl/1,4-dioxano incluyendo vacío y la sal de HCl del aminoácido resultante puede ciclarse utilizando (i) el reactivo de Ghosez DIPEA y diclorometano.   ^{[ 15 ]}

La biosíntesis de enniatina B está catalizada por la enniatina sintasa multienzimática de 347 kDa (ESYN1), purificada a partir de Fusarium oxysporum. Consta de dos módulos de activación de sustrato, EA y EB, que se unen a los hidroxiácidos o activan los aminoácidos, respectivamente. ^{[ 17 ] [ 18 ]}  

La ENN B estaba disponible en forma de medicamento (llamado Fusafungina ) debido a sus propiedades bacteriostáticas y antiinflamatorias. ^{[ 19 ]} Debido a estas propiedades, la ENN B, en una mezcla con otras enniatinas, se usaba como antibiótico local para tratar infecciones de las vías respiratorias superiores . ^{[ 19 ]} El medicamento se usaba como tratamiento tópico y se administraba por vía oral o nasal. Si bien fue autorizado por primera vez para su uso en el mercado de la UE en 1963, posteriormente fue retirado en 2016 debido a una tasa creciente de reacciones alérgicas raras pero graves. ^{[ 20 ] [ 21 ]} Además, existía una falta de evidencia sobre la eficacia y efectividad de las Fusafunginas en el tratamiento y un riesgo potencial de promover la resistencia antimicrobiana , lo que implicó aún más su eliminación del mercado. ^{[ 22 ]}  

El ENN B también está presente como un importante contaminante emergente en los cultivos alimentarios. Se ha encontrado que el ENN B contamina el maíz, el trigo, la cebada y el arroz. ^{[ 23 ]} Un estudio que investigó la exposición dietética al ENN B argumentó que la presencia en los cultivos de cereales era cercana al 100 % a nivel mundial, con un rango de 6 a 269 µg/kg basado en una muestra de 347 productos a base de cereales, siendo los niños de uno a nueve años los más expuestos. ^{[ 24 ]} Dada la falta de datos toxicológicos sobre el ENN B, no se ha realizado una evaluación de riesgo formal; sin embargo, existen preocupaciones sobre los efectos secundarios de una exposición dietética crónica a dosis bajas de ENN B. ^{[ 25 ]}

La ENN B actúa como un ionóforo lipofílico debido a su estructura de anillo anfifílico . La región hidrofóbica dentro de la estructura permite que la ENN B se intercale en las bicapas lipídicas de la membrana y se una a cationes, como K+, Na+ y Ca2+. El complejo ENN B-catión formado actúa como un canal transmembrana , a través del cual los cationes se transportan dentro y fuera de las membranas. ^{[ 26 ]} Esto conduce a un flujo de cationes descontrolado que altera el gradiente iónico normal y el potencial de membrana . ^{[ 6 ]}  

El principal mecanismo por el cual la ENN B ejerce sus efectos citotóxicos es la toxicidad mitocondrial.

El potencial de membrana y el gradiente de protones de la matriz mitocondrial son normalmente muy negativos, pero la ENN B neutraliza parcialmente esta carga al facilitar el transporte de K+ hacia la matriz mitocondrial. ^{[ 6 ] [ 27 ]} Esto impide que la fuerza electromotriz estimule la ATP sintasa , lo que produce un desequilibrio iónico que causa hinchazón mitocondrial y promueve la muerte celular. ^{[ 27 ]}  

La enniatina B se metaboliza principalmente en el hígado por enzimas del citocromo P450 de fase I , con escasa evidencia de conjugación de fase II . Ivanova et al. demostraron esto en un estudio in vitro utilizando microsomas hepáticos de rata, perro y humanos. ^{[ 12 ]} Mediante el uso de inhibidores químicos selectivos, determinaron que CYP3A, CYP1A2 y CYP2C19 participan en el metabolismo en humanos, siendo CYP3A la que más contribuye, ya que su inhibición redujo la formación de metabolitos en un 80 %. En ratas y perros, el metabolismo fue llevado a cabo principalmente por las isoformas CYP3A y CYP1A . ^{[ 12 ]}

A partir de incubaciones de microsomas hepáticos, se identificaron 12 metabolitos de fase I de ENN B. ^{[ 12 ]} Estos se agruparon en función de características similares:

• Metabolitos monohidroxilados (M1 - M5): formados por la adición de un grupo hidroxilo en diferentes posiciones de la molécula de ENN B.

• Metabolitos N-desmetilados (M6 - M7): se forman a partir de la eliminación de grupos metilo de aminoácidos N-metilados en el péptido cíclico.

• Productos de multioxidación (M8 - M12): se forman a partir de múltiples transformaciones oxidativas como la hidroxilación y la N-desmetilación.

Estudios recientes in vitro utilizando microsomas hepáticos humanos y de ratón y modelos de células HepaRG también identificaron 13 metabolitos putativos de fase I similares de ENN B, también formados por oxidación, desmetilación, hidratación y desaturación. ^{[ 28 ] [ 29 ]}

Si bien se investiga como un importante contaminante emergente en cultivos alimentarios, la enniatina B (ENN B) tiene otros usos, como compuesto antibacteriano, antifúngico, herbicida e insecticida. ^{[ 30 ] [ 31 ] [ 32 ]} Estudios recientes sugieren preliminarmente que la ENN B tiene propiedades anticancerígenas al usarse para ayudar a superar la resistencia a los medicamentos. ^{[ 33 ]} La ENN B ha mostrado potencial como antibacteriano contra enfermedades humanas al inhibir el crecimiento de microorganismos con un efecto tóxico poco significativo en las células Caco-2. ^{[ 30 ]} Dado que las células Caco-2 se utilizan para modelar la barrera intestinal humana con un efecto citotóxico mínimo, podría ser una opción como antibacteriano para humanos. Sin embargo, existe abundante evidencia que contradice esta afirmación con hallazgos como que la ENN B es tóxica incluso en dosis bajas para las células nucleadas humanas. ^{[ 34 ]}

Dado que se ha encontrado ENN B en un contaminante de cultivos importantes, es probable la exposición a través de la dieta. ^{[ 23 ]} La Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria ha declarado que la exposición aguda no presenta ningún riesgo para la salud humana; sin embargo, pueden surgir problemas en la exposición crónica a bajas dosis de ENN B, dado que es frecuente en alimentos básicos de la dieta humana y animal. ^{[ 26 ]} Además, dado que ENN B es lipofílico, puede bioacumularse e ingresar a la cadena alimentaria a través de la carne, la leche y los huevos. ^{[ 35 ]} Esto puede conducir a una mayor exposición y, por lo tanto, a riesgos de efectos secundarios.

Existe una falta de estudios in vivo sobre los efectos secundarios a largo plazo de ENN B en la salud humana. Sin embargo, estudios in vitro han demostrado una variedad de efectos toxicológicos, tales como citotoxicidad, estrés oxidativo, alteración del ciclo celular, alteración del potencial de membrana mitocondrial, alteración endocrina , apoptosis y necrosis. ^{[ 26 ]} Estos efectos se atribuyen en gran medida a la naturaleza ionofórica de ENN B. ^{[ 26 ]}

Estudios in vivo realizados en pollos de engorde (dosis: 0,2 mg/kg de peso corporal) y ratones (dosis: 5 mg/kg de peso corporal) mostraron bioacumulación tisular de ENN B, pero pocos otros efectos secundarios. ^{[ 36 ] [ 37 ]} Sin embargo, a dosis más altas (10-40 mg/kg de peso corporal), ENN B resultó fatal para los ratones. ^{[ 38 ]}

Extrapolando a partir de estudios in vitro y en animales in vivo, y micotoxinas similares a ENN B, podría tener el potencial de causar daño orgánico, particularmente a tejidos con alta tasa metabólica como el hígado, y actuar como inmunomodulador y disruptor endocrino. ^{[ 38 ] [ 39 ]} Sin embargo, dada la falta de estudios in vivo en humanos, aún no se ha llegado a una conclusión firme sobre su peligro para la salud humana ni se han confirmado sus efectos secundarios, y la investigación sobre el efecto toxicológico de ENN B continúa. ^{[ 26 ]} Además, existen complicaciones al investigar las preocupaciones sobre ENN B debido a la coexistencia con otras micotoxinas como el deoxinivalenol (DON), que puede causar un efecto sinérgico que empeora los posibles efectos secundarios. ^{[ 40 ]}

Los biomarcadores ayudan a determinar la conexión entre la exposición humana a ENN B y su influencia en la salud, ya que muestran la cantidad real de ENN B que ha sido biotransformada por el organismo. Los biomarcadores para la indicación de exposición a ENN B, y micotoxinas en general, se encuentran generalmente mediante la detección de los metabolitos de la micotoxina en la orina. ^{[ 41 ]} En humanos, las especies monooxigenadas, N-desmetiladas y dioxigenadas son los metabolitos predominantes de ENN B. ^{[ 29 ]} La sangre, la leche materna y el cabello también se pueden usar para el análisis de biomarcadores, pero la orina se usa típicamente porque es más fácil de obtener. ^{[ 42 ]} Además, dada la lipofilicidad de ENN B, se ha encontrado que se acumula en tejidos como el hígado, el tejido adiposo y los pulmones, y también se puede detectar en estos órganos. ^{[ 43 ]}

Los efectos toxicocinéticos y toxicológicos específicos debidos a la exposición a la enniatina B no se han investigado expresamente en seres humanos vivos. Sin embargo, existe amplia información sobre aplicaciones in vivo en ratones o roedores y sobre la exposición in vitro a células humanas. La exposición a la enniatina B suele producirse por ingestión oral, debido a su presencia en alimentos como hongos, frutos secos y legumbres. ^{[ 26 ]}

Experimentos in vivo, mediante la administración oral de dosis variables de Enniatina B durante un período de 2 días en ratones machos y hembras, concluyeron que existía un efecto citotóxico a dosis de 50, 100 y 200 mg/kg de peso corporal, caracterizado por hinchazón centrolobulillar del hígado. ^{[ 44 ]} Además, se observó un aumento dependiente de la dosis en la migración del ADN tanto en la médula ósea como en el hígado, también a dosis de 50, 100 y 200 mg/kg de peso corporal, lo que indica la naturaleza potencialmente genotóxica de la ENNB. ^{[ 44 ]}

La exposición in vitro de cultivos de células humanas a una familia de compuestos de enniatina demostró que afecta a las células hepáticas HepG2 más que a otros tipos de células humanas, como las intestinales Caco-2. ^{[ 45 ]} El 50 % de estas células HepG2 mostraron un comportamiento citotóxico a la dosis efectiva más baja de 1 μM, lo que resalta su naturaleza hepatotóxica. ^{[ 45 ] [ 46 ]}

La enniatina B tiene efectos sobre los genes que codifican el complejo I mitocondrial, regulándolos negativamente e inhibiendo la fosforilación oxidativa, lo que reduce la producción de energía de las células. ^{[ 45 ] [ 46 ]} Además, la estimulación de especies reactivas de oxígeno aumenta el estrés oxidativo en las células afectadas. Junto con la inhibición de la actividad mitocondrial, esto finalmente conduce a la muerte celular por apoptosis. ^{[ 45 ] [ 25 ]}

Aunque actualmente no existen límites de exposición ocupacional establecidos para la enniatina B debido a la falta de información sobre su toxicidad, se han realizado evaluaciones de la exposición promedio para diferentes grupos de edad en Europa que se muestran en la tabla 1. ^{[ 24 ]}

Tabla 1: Exposición media diaria en nanogramos por kilogramo de peso corporal para todos los grupos de edad.