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Articulo de referencia

Secuenciación epitranscriptómica

En la secuenciación epitranscriptómica , la mayoría de los métodos se centran en (1) el enriquecimiento y la purificación de las moléculas de ARN modificadas antes de su procesa...

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En la secuenciación epitranscriptómica , la mayoría de los métodos se centran en (1) el enriquecimiento y la purificación de las moléculas de ARN modificadas antes de su procesamiento en el secuenciador de ARN , o (2) la mejora o modificación de los flujos de trabajo de análisis bioinformático para identificar los picos de modificación. La mayoría de los métodos se han adaptado y optimizado para moléculas de ARNm , excepto la secuenciación de bisulfito modificada para el perfilado de 5-metilcitidina, que se optimizó para ARNt y ARNr .

Diagrama esquemático de los flujos de trabajo de secuenciación epitranscriptómica.

Existen siete clases principales de modificaciones químicas en las moléculas de ARN: N6 - metiladenosina , 2'-O-metilación , N6,2'-O-dimetiladenosina , 5-metilcitidina , 5-hidroximetilcitidina , inosina y pseudouridina . [ 1 ] [ 2 ] Se han desarrollado diversos métodos de secuenciación para perfilar cada tipo de modificación. Se analizarán la escala, la resolución, la sensibilidad y las limitaciones asociadas a cada método, así como las herramientas bioinformáticas correspondientes.

Las principales clases de modificaciones del ARN.

Métodos para perfilar la N 6 -metiladenosina

La metilación de la adenosina no afecta su capacidad de aparearse con timidina o uracilo , por lo que la N 6 -metiladenosina (m 6 A) no se puede detectar utilizando métodos estándar de secuenciación o hibridación . [ 3 ] Esta modificación está marcada por la metilación de la base de adenosina en la posición nitrógeno-6. Se encuentra abundantemente en el ARNm poliA +; también se encuentra en el ARNt, ARNr, ARNsn y ARNnc largo .

Métodos desarrollados para perfilar la N 6 -metiladenosina.

m6A-seq y MeRIP-seq

En 2012, se publicaron los dos primeros métodos de secuenciación de m6A que permitieron obtener un perfil de m6A en todo el transcriptoma de células de mamíferos. [ 1 ] Estas dos técnicas, denominadas m6A-seq y MeRIP-seq ( inmunoprecipitación de ARN metilado específico de m6A ), son también los primeros métodos que permiten la secuenciación de cualquier tipo de modificación del ARN. Estos métodos pudieron detectar 10 000 picos de m6A en el transcriptoma de mamíferos; se encontró que los picos estaban enriquecidos en regiones 3'UTR, cerca de codones de parada y dentro de exones largos. [ 4 ] [ 3 ]

Los dos métodos se optimizaron para detectar picos de metilación en ARNm poli(A)+, pero el protocolo podría adaptarse para perfilar cualquier tipo de ARN. La muestra de ARN recolectada se fragmenta en oligonucleótidos de ~100 nucleótidos de longitud utilizando un tampón de fragmentación, inmunoprecipitación con anticuerpo anti-m6A purificado, elución y recolección de moléculas de ARN marcadas con anticuerpos. El procedimiento de inmunoprecipitación en MeRIP-Seq es capaz de producir un enriquecimiento >130 veces de secuencias m6A. [ 3 ] Se realizó la generación de una biblioteca de ADNc con cebadores aleatorios, seguida de la ligación de adaptadores y la secuenciación Illumina. Dado que las hebras de ARN se cortan aleatoriamente, el sitio m6A debería, en principio, estar en algún lugar del centro de las regiones a las que se alinean las lecturas de secuencia. En los extremos, la región tendría aproximadamente 200 nt de ancho (100 nt aguas arriba y aguas abajo del sitio m6A). [ 3 ]

Cuando el primer nucleótido de un transcrito es una adenosina, además de la 2'-O-metilación de la ribosa , esta base puede metilarse aún más en la posición N6. [ 1 ] Se confirmó que m6A-seq puede detectar picos de m6Am en los sitios de inicio de la transcripción. [ 5 ] [ 4 ] La ligación del adaptador en ambos extremos del fragmento de ARN da como resultado lecturas que tienden a acumularse en el extremo 5' del transcrito. Schwartz et al. (2015) aprovecharon este conocimiento para detectar sitios mTSS seleccionando sitios con una alta proporción del tamaño de las acumulaciones en las muestras IP en comparación con la muestra de entrada. [ 4 ] Como confirmación, >80% de los sitios de acumulación altamente enriquecidos contenían adenosina.

La resolución de estos métodos es de 100-200 nt, que era el rango del tamaño del fragmento. Estos dos métodos tenían varios inconvenientes: (1) requerían una cantidad considerable de material de entrada, (2) baja resolución que dificultaba la localización precisa del sitio real con la marca m6A, y (3) no podían evaluar directamente los falsos positivos. [ 6 ]

Especialmente en MeRIP-Seq, las herramientas bioinformáticas disponibles actualmente solo pueden detectar 1 sitio por cada pico de ~100-200 nt de ancho, por lo que se pierde una porción sustancial de m6A agrupados (~64 nt entre cada sitio individual dentro de un grupo). [ 7 ] [ 8 ] Cada grupo puede contener hasta 15 residuos de m6A. [ 7 ] [ 8 ]

En 2013, se publicó una versión modificada de m6A-seq basada en los dos métodos anteriores, m6A-seq y MeRIP-seq, que buscaba aumentar la resolución y lo demostró en el transcriptoma de levadura. Lo lograron reduciendo el tamaño de los fragmentos y empleando un protocolo de preparación de bibliotecas específico de cadena basado en ligación que capturaba ambos extremos del ARN fragmentado, asegurando que la posición metilada estuviera dentro del fragmento secuenciado. [ 6 ] Al referenciar adicionalmente el motivo consenso m6A y eliminar los picos falsos positivos de m6A utilizando muestras de control negativo, se pudo realizar el perfilado de m6A en levadura con resolución de una sola base.

Métodos basados ​​en luz ultravioleta

PA-m6A-seq

Se añadió el entrecruzamiento de anticuerpos de ARN inducido por UV sobre m6A-seq para producir PA-m6A-seq (m6A-seq asistido por fotoentrecruzamiento), que aumenta la resolución hasta ~23 nt. Primero, se incorpora 4-tiourodina (4SU) al ARN añadiendo 4SU al medio de cultivo , algunos sitios de incorporación presumiblemente cerca de la ubicación de m6A. Luego se realiza una inmunoprecipitación en el ARN de longitud completa utilizando un anticuerpo específico para m6A [36].  A continuación, se ilumina el ARN con luz UV a 365 nm para activar el entrecruzamiento con el anticuerpo mediante 4SU. El ARN entrecruzado se aisló mediante elución competitiva y se fragmentó aún más a ~25-30 nt; se utilizó proteinasa K para disociar el enlace covalente entre el sitio de entrecruzamiento y el anticuerpo. [ 6 ] Los fragmentos peptídicos que quedan después de la eliminación del anticuerpo del ARN hacen que la base se lea como una C en lugar de una T durante la transcripción inversa, induciendo efectivamente una mutación puntual en el sitio de entrecruzamiento 4SU. [ 6 ] Los fragmentos cortos se someten a la construcción de la biblioteca y a la secuenciación Illumina , seguida de la búsqueda de la secuencia de metilación consenso. La presencia de la mutación de T a C ayuda a aumentar la relación señal/ruido de la detección del sitio de metilación [ 1 ] además de proporcionar una mayor resolución a la secuencia de metilación. Una desventaja de este método es que los sitios m6A que no incorporaron 4SU no se pueden detectar. Otra advertencia es que la posición de incorporación de 4SU puede variar en relación con cualquier residuo m6A individual, por lo que sigue siendo un desafío localizar con precisión el sitio m6A utilizando la mutación de T a C.

m6A-CLIP y miCLIP

m6A-CLIP [ 7 ] (inmunoprecipitación con entrecruzamiento) y miCLIP [ 8 ] (entrecruzamiento e inmunoprecipitación con resolución de nucleótidos individuales de m6A) son técnicas de secuenciación basadas en luz ultravioleta. Estos dos métodos activan el entrecruzamiento a 254  nm, fragmentan las moléculas de ARN antes de la inmunoprecipitación con anticuerpos y no dependen de la incorporación de ribonucleósidos fotoactivables: el anticuerpo se entrecruza directamente con una base cercana (ubicación muy predecible) al sitio m6A. Estas estrategias basadas en luz ultravioleta utilizan anticuerpos que inducen patrones de mutación y truncamiento consistentes y predecibles en la cadena de ADNc durante la retrotranscripción, lo que podría aprovecharse para localizar con mayor precisión el sitio m6A. [ 7 ] [ 8 ] Aunque tanto m6A-CLIP como miCLIP dependen de mutaciones inducidas por UV, m6A-CLIP [ 7 ] se distingue por aprovechar que m6A por sí solo puede inducir la truncación del ADNc durante la transcripción inversa y generar un mapeo de un solo nucleótido para más de diez veces más sitios de m6A precisos (MITS, sitios de truncamiento inducidos por m6A), lo que permite un mapeo de m6A preciso, completo e imparcial. [ 7 ] En contraste, los sitios de m6A mapeados por UV mediante miCLIP son solo un pequeño subconjunto del total de sitios de m6A precisos. La ubicación precisa de decenas de miles de sitios de m6A en ARNm humanos y de ratón mediante m6A-CLIP revela que m6A está enriquecido en el último exón, pero no alrededor del codón de parada . [ 7 ]

En m6A-CLIP [ 7 ] y miCLIP, [ 8 ] el ARN se fragmenta primero a ~20-80nt, luego el  complejo covalente de ARN/anticuerpo m6A inducido por UV de 254 nm se formó en los fragmentos que contienen m6A. El anticuerpo se eliminó con proteinasa K antes de la retrotranscripción, la construcción de la biblioteca y la secuenciación. Los restos de péptidos en el sitio de entrecruzamiento en el ARN después de la eliminación del anticuerpo, conducen a inserciones, truncamientos y mutaciones de C a T durante la retrotranscripción a cDNA, especialmente en la posición +1 al sitio m6A (5' al sitio m6A) en las lecturas de secuencia. [ 7 ] [ 8 ] Los sitios positivos vistos usando m6A-CLIP y miCLIP tuvieron un alto porcentaje de coincidencias con los detectados usando SCARLET , que tiene una resolución local más alta alrededor de un sitio específico, (ver más abajo), lo que implica que m6A-CLIP y miCLIP tienen una alta resolución espacial y una baja tasa de descubrimiento falso. [ 7 ] [ 8 ] miCLIP se ha utilizado para detectar m6Am observando los sitios de truncamiento inducidos por entrecruzamiento en la 5'UTR. [ 8 ]

Métodos para cuantificar el estado de modificación m6A

Aunque los sitios m6A se pueden perfilar con alta resolución utilizando métodos basados ​​en UV, la estequiometría de los sitios m6A (el estado de metilación o la proporción de m6A+ a m6A- para cada sitio individual dentro de un tipo de ARN) aún se desconoce. SCARLET (2013) y m6A-LAIC-seq (2016) permiten cuantificar la estequiometría en un locus específico y en todo el transcriptoma, respectivamente. [ 1 ]

Los métodos bioinformáticos utilizados para analizar los picos de m6A no hacen suposiciones previas sobre los motivos de secuencia dentro de los cuales se encuentran habitualmente los sitios de m6A, y toman en consideración todos los motivos posibles. Por lo tanto, es menos probable que se pasen por alto sitios. [ 8 ]

ESCARLATA

SCARLET (escisión específica del sitio y marcaje radiactivo seguido de extracción asistida por ligación y cromatografía de capa fina) se utiliza para determinar la fracción de ARN en una muestra que contiene una adenina metilada en un sitio específico. Se puede partir del ARN total sin necesidad de enriquecer la molécula de ARN objetivo. Por lo tanto, es un método especialmente adecuado para cuantificar el estado de metilación en ARN de baja abundancia, como los ARNt. Sin embargo, no es adecuado ni práctico para la localización a gran escala de sitios m6A. [ 8 ] [ 9 ]

El procedimiento comienza con la hibridación de un oligonucleótido de ADN quimérico al ARN diana alrededor del sitio de modificación candidato. El ssDNA quimérico tiene modificaciones 2'OMe/2'H y es complementario a la secuencia diana. El oligonucleótido quimérico sirve como guía para permitir que la RNasa H corte la cadena de ARN precisamente en el extremo 5' del sitio candidato. El sitio de corte se marca con fósforo-32 y se liga a un oligonucleótido de ssDNA de 116 nt mediante ligasa de ADN . [ 10 ] Se introduce RNasa T1/A en la muestra para digerir todo el ARN, excepto las moléculas de ARN con los 116-meros de ADN unidos. Este producto marcado se aísla y se digiere con nucleasa para generar una mezcla de adenosinas modificadas y no modificadas (5'P-m6A y 5'-PA), que se separa mediante cromatografía de capa fina. Las proporciones relativas de los dos grupos se pueden determinar utilizando los niveles de absorción UV. [ 9 ]

m6A-LAIC-seq

m6A-LAIC-seq (secuenciación de caracterización de isoformas y niveles de m6A) es un método de alto rendimiento para cuantificar el estado de metilación a escala de todo el transcriptoma. En este método se utilizan muestras de ARN de longitud completa. Los ARN se someten primero a inmunoprecipitación con un anticuerpo anti-m6A. Se añade un exceso de anticuerpo a la mezcla para asegurar que todos los ARN que contienen m6A se extraigan. La mezcla se separa en eluato (ARN m6A+) y sobrenadante (ARN m6A-). Se añaden marcadores de referencia del Consorcio de Controles de ARN Externos (ERCC) al eluato y al sobrenadante, así como un brazo de control independiente que consiste únicamente en marcadores de referencia de ERCC. Tras la digestión con anticuerpos en el eluato, cada una de las tres mezclas se secuencia en una plataforma de secuenciación de nueva generación. Los niveles de m6A por sitio o gen se pueden cuantificar mediante las abundancias de ARN normalizadas por ERCC en los diferentes grupos. [ 1 ] [ 11 ] Dado que se utiliza ARN de longitud completa, es posible comparar directamente las isoformas de empalme alternativo entre las fracciones m6A+ y m6A-, así como comparar la abundancia de isoformas dentro de la porción m6A+.

A pesar de los avances en la secuenciación de m6A, aún persisten varios desafíos: (1) Todavía no se ha desarrollado un método que caracterice la estequiometría entre diferentes sitios en el mismo transcrito; (2) Los resultados del análisis dependen en gran medida del algoritmo bioinformático utilizado para llamar a los picos; (3) Todos los métodos actuales utilizan anticuerpos específicos de m6A para marcar los sitios de m6A, pero se ha informado que los anticuerpos contienen un sesgo intrínseco para las secuencias de ARN.

Métodos para la determinación del perfil de 2'-O-metilación

La 2'-O-metilación de la porción de ribosa es una de las modificaciones de ARN más comunes y está presente en diversos ARN no codificantes (ARNnc) altamente abundantes y en la caperuza 5' de los ARNm. [ 12 ] Además, muchos estudios han revelado que la Nm en el extremo 3' está presente en algunos ARNnc, como los microARN (miARN) en plantas, así como los ARN que interactúan con PIWI (piARN) en animales. Esta modificación puede perturbar la función de los ribosomas y alterar la decodificación del ARNt, regular la fidelidad del empalme alternativo, proteger los ARNnc de la degradación exonucleolítica 3'-5' y proporcionar una firma molecular para la discriminación del ARNm propio del ajeno.

Nm-REP-seq

Se desarrolló un método novedoso, Nm-REP-seq, para la identificación a nivel de transcriptoma de sitios de 2'-O-metilación con resolución de una sola base mediante el uso de ARN exorribonucleasa (ARNasa R de Mycoplasma genitalium, MgR) y reactividad de oxidación con periodato para eliminar nucleósidos 2'-hidroxilados (2'-OH). [ 13 ] Nm-REP-seq descubrió el ARN del componente de ARN de la telomerasa (TERC), los scaRNA y los snoRNA como nuevas clases de ncRNA que contienen Nm, además de identificar muchos sitios de 2'-O-metilación en varios ncRNA y mRNA. Además, Nm-REP-seq reveló 2'-O-metilación ubicada en el extremo 3' de snoRNA, snRNA, tRNA y fragmentos derivados de ellos, así como piRNA y miRNA.

Métodos para la determinación del perfil de N6,2'-O-dimetiladenosina (m6Am)

La N6,2'-O-dimetiladenosina , abundante en los ARNm poliA+ , se produce en el primer nucleótido después de la caperuza 5' , cuando se añade un grupo metilo adicional a un residuo de 2ʹ-O-metiladenosina en el extremo 5ʹ 'caperuzado' del ARNm. [ 1 ]

Dado que la m6Am puede ser reconocida por anticuerpos anti-m6A en los sitios de inicio de la transcripción , los métodos utilizados para la elaboración de perfiles de m6A pueden adaptarse, y de hecho se adaptaron, para la elaboración de perfiles de m6Am, a saber, m6A-seq y miCLIP (véanse las descripciones de m6A-seq y miCLIP más arriba).

Métodos para la determinación del perfil de 5-metilcitidina

Métodos desarrollados para caracterizar la 5-metilcitidina.

La 5-metilcitidina , m5C, se encuentra abundantemente en el ARNm y los ARNnc, especialmente en el ARNt y el ARNr. En los ARNt, esta modificación estabiliza la estructura secundaria e influye en la conformación del bucle del tallo del anticodón . [ 1 ] En los ARNr, la m5C afecta la fidelidad de la traducción . [ 1 ]

Para desarrollar métodos de secuenciación de m5C se han utilizado dos principios. El primero es un enfoque basado en anticuerpos (secuenciación con bisulfito y m5C-RIP ), similar a la secuenciación de m6C. El segundo consiste en detectar los objetivos de las ARN metiltransferasas de m5C mediante la unión covalente de la enzima a su objetivo, y luego utilizar una inmunoprecipitación específica para la enzima objetivo para enriquecer las moléculas de ARN que contienen la marca (Aza-IP y miCLIP).

Secuenciación con bisulfito modificada

La secuenciación de bisulfito modificada se optimizó para moléculas de ARNr, ARNt y ARNm de Drosophila . [ 14 ] El tratamiento con bisulfito se ha utilizado más ampliamente para detectar dm5C ( ADN m5C ). El tratamiento esencialmente convierte una citosina en una uridina , pero las citosinas metiladas no se verían afectadas por el tratamiento. Los intentos previos de desarrollar protocolos de secuenciación de m5C utilizando tratamiento con bisulfito no pudieron abordar eficazmente el problema del tratamiento agresivo del ARN que causa una degradación significativa de las moléculas. Específicamente, el tratamiento de desaminación con bisulfito (pH alto) del ARN es perjudicial para la estabilidad de los enlaces fosfodiéster . Como resultado, es difícil pre-enriquecer moléculas de ARN u obtener suficiente producto de PCR del tamaño correcto para la secuenciación profunda .

Schaefer et al. (2009) desarrollaron una versión modificada de la secuenciación con bisulfito que redujo la temperatura del tratamiento con bisulfito del ARN de 95  °C a 60  °C. [ 14 ] La razón de esta modificación fue que, dado que el ARN, a diferencia del ADN, no es de doble cadena, sino que consta de regiones de cadena simple, estructuras de tallo de doble cadena y bucles, podría ser posible desenrollar el ARN a una temperatura mucho más baja. De hecho, el ARN pudo tratarse durante 180 minutos a 60 °C sin una pérdida significativa de amplicones de PCR del tamaño esperado. [ 14 ] Se determinó que las tasas de desaminación eran del 99 % a los 180 minutos de tratamiento.

Después del tratamiento con bisulfito del ARN fragmentado, se realiza la transcripción inversa, seguida de la amplificación por PCR de los productos de ADNc, y finalmente se realizó la secuenciación profunda utilizando la plataforma Roche 454. [ 14 ]

Dado que los desarrolladores del método utilizaron la plataforma Roche, también utilizaron GS Amplicon Variant Analyzer (Roche) para analizar datos de secuenciación profunda y cuantificar el contenido de citosina específico de la secuencia. Sin embargo, artículos recientes han sugerido que el método tiene varias fallas: (1) Conversión incompleta de citosinas regulares en regiones de ARN de doble cadena; (2) áreas que contienen otras modificaciones que resultaron en resistencia al tratamiento con bisulfito; y (3) sitios que contienen posibles falsos positivos debido a (1) y (2) [ 15 ] [ 16 ] [ 17 ] Además, es posible que la profundidad de secuenciación aún no sea lo suficientemente alta como para detectar correctamente todos los sitios metilados. [ 1 ]

Aza-IP

La inmunoprecipitación de ARN mediada por 5-azacitidina Aza-IP se ha optimizado y utilizado para detectar objetivos de metiltransferasas , en particular NSUN2 y DNMT2 [ 18 ] , las dos enzimas principales responsables de establecer la marca m5C.

Primero, se induce en la célula la sobreexpresión de un derivado de la ARN metiltransferasa m5C marcado con un epítopo , de modo que el anticuerpo utilizado posteriormente para la inmunoprecipitación pueda reconocer la enzima. Segundo, se introduce 5-aza-C en las células para que se incorpore al ARN naciente en lugar de la citosina. Normalmente, las metiltransferasas se liberan (es decir, se rompe el enlace covalente entre la citosina y la metiltransferasa) tras la metilación del residuo. En el caso de la 5-aza-C, debido a una sustitución de nitrógeno en la posición C5 de la citosina, la enzima ARN metiltransferasa permanece unida covalentemente a la molécula de ARN diana en la posición C6. [ 18 ]

En tercer lugar, se lisa la célula y se inmunoprecipita la m5C-ARN metiltransferasa de interés junto con las moléculas de ARN unidas covalentemente a la proteína. El paso de inmunoprecipitación permitió un enriquecimiento de más de 200 veces de los ARN diana, que eran principalmente ARNt. Las moléculas enriquecidas se fragmentaron y purificaron. Posteriormente, se construyó una biblioteca de ADNc y se realizó la secuenciación. [ 18 ]

Una característica adicional importante es que la unión covalente de la ARN metiltransferasa al C5 de m-aza-C induce un reordenamiento y apertura del anillo . Esta apertura del anillo resulta en un apareamiento preferencial con citosina y, por lo tanto, se lee como guanosina durante la secuenciación. Esta transversión de C a G permite la detección de sitios m5C con resolución de base. [ 1 ] Una advertencia es que los sitios m5C que no sean reemplazados por 5-azacitosina no se detectarán.

miCLIP

Se utilizó miCLIP ( inmunoprecipitación de entrecruzamiento inducido por metilación ) para detectar los objetivos de NSUN2 , que resultaron ser principalmente ARN no codificantes como el ARNt. Una mutación inducida de C271A en NSUN2 inhibe la liberación de la enzima del ARN objetivo. Esta mutación se sobreexpresó en las células de interés, y el NSUN2 mutado también se marcó con el epítopo Myc . Los complejos de ARN-proteína unidos covalentemente se aíslan mediante inmunoprecipitación con un anticuerpo específico para Myc. Estos complejos se confirman y detectan mediante marcaje radiactivo con fósforo-32 . Posteriormente, el ARN se extrae del complejo, se transcribe inversamente, se amplifica mediante PCR y se secuencia utilizando plataformas de secuenciación de nueva generación.

Tanto miCLIP como Aza-IP, aunque limitados por la especificidad de las enzimas, permiten la detección de ARN metilado de baja abundancia sin secuenciación profunda. [ 1 ]

Métodos para la determinación del perfil de inosina

La inosina se crea enzimáticamente cuando se modifica un residuo de adenosina.

Método de identificación de la inosina: La inosina se aparea con la citidina, mientras que la adenosina se aparea con el uracilo.

Análisis de las propiedades de apareamiento de bases

Dado que la composición química de la inosina es una adenosina desaminada, esta es una de las pocas alteraciones de metilación que conlleva una alteración en el apareamiento de bases, lo cual puede aprovecharse. El nucleótido de adenosina original se apareará con una timina, mientras que la inosina metilada se apareará con una citosina. Por lo tanto, las secuencias de ADNc obtenidas mediante RT-PCR pueden compararse con las secuencias genómicas correspondientes; en los sitios donde los residuos de adenina se interpretan repetidamente como guanina, se puede asumir un evento de metilación. Con una precisión suficientemente alta, es posible calcular como porcentaje la cantidad de moléculas de ARNm en la población que han sido metiladas. Este método tiene una resolución potencial de un solo nucleótido. De hecho, la abundancia de datos de secuenciación de ARN (RNA-seq) disponibles públicamente puede utilizarse para investigar la guanina (en el ADNc) frente a la adenina (en el genoma). Una metodología en particular, denominada diferencias de ARN y ADN (RDD), afirma excluir los falsos positivos, pero solo el 56,8% de sus sitios A-a-I resultaron ser válidos según ICE-seq [ 19 ] (ver más abajo).

Limitaciones

El ruido de fondo causado por polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), mutaciones somáticas, pseudogenes y errores de secuenciación reduce la fiabilidad de la señal, especialmente en un contexto de célula única. [ 20 ]

Métodos químicos

Escisión específica de inosina

El primer método para detectar modificaciones de ARN de A a I, desarrollado en 1997, fue la escisión específica de inosina. Las muestras de ARN se tratan con glioxal y borato para modificar específicamente todas las bases G, y posteriormente se digieren enzimáticamente con la RNasa T1, que escinde después de los sitios I. La amplificación de estos fragmentos permite analizar los sitios de escisión e inferir la modificación de A a I. [ 21 ] Se utilizó para demostrar la posición de la inosina en sitios específicos en lugar de identificar sitios nuevos o perfiles de todo el transcriptoma.

Limitaciones

La existencia de dos modificaciones de A a I relativamente próximas, algo común en los elementos Alu, implica que la modificación posterior tiene menos probabilidades de ser detectada, ya que la síntesis de ADNc se truncará en un nucleótido anterior. El rendimiento es bajo y el método inicial requería cebadores específicos; el protocolo es complejo y laborioso.

ICE e ICE-seq

La eliminación química de inosina (ICE) se refiere a un proceso en el que el acrilonitrilo reacciona con la inosina para formar N1-cianoetilinosina (ce1I). Esto sirve para detener la transcriptasa inversa y dar lugar a moléculas de ADNc truncadas. Esto se combinó con la secuenciación profunda en un método desarrollado llamado ICE-seq. Existen métodos computacionales para el análisis automatizado de los datos, cuya premisa principal es la comparación de muestras tratadas y no tratadas para identificar transcritos truncados y, por lo tanto, inferir una modificación de inosina mediante el recuento de lecturas, con un paso para reducir los falsos positivos mediante la comparación con la base de datos en línea dbSNP. [ 22 ]

Limitaciones

El protocolo ICE original implicaba un paso de amplificación RT-PCR y, por lo tanto, requería cebadores y conocimiento de la ubicación o regiones a investigar, [ 23 ] junto con una longitud máxima de cDNA de 300–500 pb. El método ICE-seq es complicado, además de ser laborioso, intensivo en reactivos y tiempo. Un protocolo de 2015 tardó 22 días. [ 23 ] [ 22 ] [ 19 ] Esto comparte una limitación con la escisión específica de inosina, en el sentido de que si hay dos modificaciones de A a I en proximidad relativamente cercana, es menos probable que se detecte la modificación corriente abajo ya que la síntesis de cDNA se truncará en un nucleótido anterior. [ 24 ] Tanto ICE como ICE-seq sufren de falta de sensibilidad a ubicaciones editadas con poca frecuencia: se vuelve difícil distinguir una modificación con una frecuencia de <10% de un falso positivo. Un aumento en la profundidad y la calidad de la lectura puede incrementar la sensibilidad, pero también puede conllevar un mayor sesgo de amplificación.

Métodos biológicos

derribo ADAR

La modificación de A a I es efectuada por las adenosina desaminasas que actúan sobre el ARN (ADAR), de las cuales existen tres en ratones. Por lo tanto, se esperaría que la inactivación de estas enzimas en la célula y la posterior comparación célula-célula del contenido de ARN ADAR+ y ADAR- proporcionaran una base para el perfilado de la modificación de A a I. Sin embargo, existen otras funciones de las enzimas ADAR dentro de la célula —por ejemplo, desempeñan otros roles en el procesamiento del ARN y en la biogénesis de miRNA— que también podrían cambiar el panorama del ARNm celular. Recientemente, se generó un mapa de la edición de A a I en ratones utilizando ratones doble knockout deficientes en edición ADAR1 y ADAR2 como control negativo. De este modo, se detectó la edición de A a I con alta confianza. [ 25 ]

Métodos para la elaboración de perfiles de metilación de pseudouridina

Detección de inosina y pseudouridina mediante técnicas basadas en ICE y CMC. En ambos casos se produce una molécula de ADNc truncada.

La pseudouridina , o Ψ, la modificación postraduccional del ARN más abundante en general , [ 26 ] se crea cuando una base uridina se isomeriza. En eucariotas , esto puede ocurrir por cualquiera de dos mecanismos distintos; [ 27 ] [ 28 ] a veces se la denomina el "quinto nucleótido de ARN". Se incorpora a ARN no codificantes estables como el ARNt, el ARNr y el ARNsn, [ 29 ] con funciones en la unión de ligandos ribosomales y la fidelidad de la traducción en el ARNt, [ 30 ] [ 31 ] y en el ajuste fino de los eventos de ramificación y los eventos de empalme en los ARNsn. [ 32 ] La pseudouridina tiene un donador de enlace de hidrógeno más de un grupo imino y un enlace C–C más estable, ya que un enlace C-glicosídico ha reemplazado el enlace N-glicosídico que se encuentra en su contraparte (uridina regular). [ 33 ] Como ninguno de estos cambios afecta sus propiedades de apareamiento de bases, ambos tendrán el mismo resultado cuando se secuencien directamente; por lo tanto, los métodos para su detección implican una modificación bioquímica previa. [ 34 ]

Métodos bioquímicos

Métodos CMCT

Existen múltiples métodos de detección de pseudouridina que comienzan con la adición de N-ciclohexil-N′-b-(4-metilmorfolinio) etilcarbodiimida meto-p-toluenosulfonato (CMCT; también conocido como CMC), ya que su reacción con pseudouridina produce CMC-Ψ. El CMC-Ψ hace que la transcriptasa inversa se detenga un nucleótido en la dirección 3'. [ 35 ] Estos métodos tienen resolución de un solo nucleótido. En un paso de optimización, el azido-CMC puede conferir la capacidad de agregar biotinilación ; la posterior precipitación con biotina enriquecerá los transcritos que contienen Ψ, lo que permite la identificación incluso de transcritos de baja abundancia.

Limitaciones

Al igual que otros procedimientos basados ​​en la alteración bioquímica seguida de secuenciación, el desarrollo de la secuenciación de alto rendimiento ha eliminado las limitaciones que requerían conocimiento previo de los sitios de interés y el diseño de los cebadores . El método causa mucha degradación del ARN, por lo que es necesario comenzar con una gran cantidad de muestra o utilizar técnicas de normalización efectivas para tener en cuenta los sesgos de amplificación . Una limitación final es que, para que el marcaje con CMC de la pseudouridina sea específico, no es completo y, por lo tanto, tampoco es cuantitativo. [ 36 ] Un nuevo reactivo que pudiera lograr una mayor sensibilidad con especificidad sería beneficioso.

Métodos para la determinación del perfil de 5-hidroximetilcitidina

Los residuos de citidina, modificados una vez a m5C (como se mencionó anteriormente), pueden modificarse aún más: oxidarse una vez para formar 5-hidroximetilcitidina (hm5C) o dos veces para formar 5-formilcitidina (f5C). La hm5C, que surge del procesamiento oxidativo de m5C llevado a cabo en mamíferos por enzimas de la familia de translocación ten-eleven ( TET ), se encuentra en los tres reinos y desempeña funciones de regulación. Si bien se sabe que la 5-hidroximetilcitidina (hm5dC) se encuentra ampliamente distribuida en el ADN, la hm5C también se encuentra en organismos donde no se ha detectado hm5dC, lo que indica que se trata de un proceso independiente con estipulaciones regulatorias distintas. Para observar la adición in vivo de grupos metilo a los residuos de ARN de citosina, seguida del procesamiento oxidativo, se puede alimentar a ratones con una dieta que incorpore isótopos específicos y rastrearlos mediante análisis LC- MS/MS . Dado que se sabe que la vía metabólica desde la ingesta nutricional hasta la incorporación de nucleótidos progresa desde la metionina dietética --> S-adenosilmetionina (SAM) --> grupo metilo en la base del ARN, el marcaje de la metionina dietética con 13C y D significa que estos terminarán en residuos de hm5C que han sido alterados desde su adición a la dieta. [ 37 ] A diferencia de m5C, se ha registrado una gran cantidad de modificaciones de hm5C dentro de secuencias codificantes. [ 38 ]

hMeRIP-seq

hMeRIP-seq es un método de inmunoprecipitación en el que los complejos de ARN-proteína se reticulan para mayor estabilidad y se añaden anticuerpos específicos para hm5C. Mediante este método, se han detectado más de 3000 picos de hm5C en células S2 de Drosophila melanogaster .

Limitaciones

A pesar de que existen dos métodos distintos de resolución de bases para hm5dC, no existen métodos de resolución de bases para la detección de hm5C.

Validación biofísica de las modificaciones del ARN

Además de la espectrometría de masas y la cromatografía , se han desarrollado otras dos técnicas de validación, a saber:

  1. Técnicas de pre y post-etiquetado :
  • Premarcado → implica el uso de 32 P: las células se cultivan en un medio que contiene 32 P, lo que permite la incorporación de [α- 32 P]NTP durante la transcripción por la ARN polimerasa T7. A continuación, se extrae el ARN modificado, se aísla cada especie de ARN y posteriormente se digiere con la ARNasa T2. Después, el ARN se hidroliza en 5' nucleósido monofosfatos, que se analizan mediante cromatografía de capa fina bidimensional ( 2D-TLC ). Este método permite detectar y cuantificar cada modificación, pero no contribuye a la caracterización de la secuencia.
  • El marcaje posterior implica el marcaje selectivo de una posición específica dentro de la secuencia: estas técnicas se basan en los principios del método de Stanley-Vassilenko, que se ha ajustado para lograr una mejor calidad de validación. Primero, el ARN se escinde en fragmentos 5'-OH libres mediante la RNasa H o las ADNzimas, por hidrólisis específica de secuencia. La polinucleótido quinasa (PKN) realiza entonces la fosforilación de marcaje posterior radiactivo en 5' utilizando [γ- 32P ]ATP. En este punto, los fragmentos marcados sufren una fragmentación por tamaño, que puede realizarse mediante la nucleasa P1 o según el método SCARLET. En ambos casos, el producto final es un grupo de nucleósido monofosfatos 5' (5'NMP) que se analizarán por TLC.
    • SCARLET: este método reciente utiliza no uno, sino dos pasos de selección de secuencia. El último se obtiene durante la ligación dirigida de los fragmentos marcados radiactivamente con un oligonucleótido de ADN largo en su extremo 3'. Tras la degradación, el residuo marcado se purifica junto con el oligonucleótido de ADN ligado y, finalmente, se hidroliza y se libera gracias a la actividad de la nucleasa P1.

Este método ha demostrado ser muy útil en la validación de residuos modificados en ARNm y ARNnc largos , como m6A y Ψ.

  1. Técnicas basadas en oligonucleótidos : este método incluye varias variantes.
  • Ligación dirigida de ADN modificados específicos , que aprovecha la sensibilidad de la ligasa a los nucleótidos 3' y 5' (hasta ahora utilizada para m6A, 2'-O-Me, Ψ).
  • Identificación de modificaciones mediante microarrays a través de un chip de ADN , que aprovecha la disminución de la estabilidad del dúplex de los oligonucleótidos de ADNc, debido al impedimento en el apareamiento de bases convencional causado por modificaciones (por ejemplo, m1A, m1G, m22G).
  • Extensión del cebador de RT a baja concentración de dNTPs , para el mapeo de señales de detención de RT. [ 38 ]

Secuenciación en tiempo real de molécula única para la secuenciación del epitranscriptoma

La secuenciación en tiempo real de molécula única (SMRT) se utiliza en los campos epigenómico y epitranscriptómico. En cuanto a la epigenómica , se utilizan miles de guías de onda de modo cero (ZMW) para capturar la ADN polimerasa : cuando hay una base modificada, la dinámica biofísica de su movimiento cambia, creando una firma cinética única antes, durante y después de la incorporación de la base. La secuenciación SMRT se puede utilizar para detectar bases modificadas en el ARN, incluidos los sitios m6A. En este caso, se utiliza una transcriptasa inversa como enzima con ZMW para observar la síntesis de ADNc en tiempo real. La incorporación de sitios m6A diseñados sintéticamente deja una firma cinética y aumenta la duración entre pulsos (IPD). Existen algunos problemas con respecto a la lectura de tramos de homonucleótidos y la resolución de bases de m6A en ellos, debido al tartamudeo de la transcriptasa inversa. En segundo lugar, el rendimiento es demasiado bajo para enfoques a nivel de transcriptoma. Una de las plataformas más utilizadas es la tecnología de secuenciación SMRT de Pacific Biosciences . [ 39 ]

Secuenciación de nanoporos en epitranscriptómica

Una posible alternativa a la detección de modificaciones epitranscriptómicas mediante secuenciación SMRT es la detección directa utilizando tecnologías de secuenciación de nanoporos . Esta técnica aprovecha canales proteicos de tamaño nanométrico incrustados en una membrana o materiales sólidos, y acoplados a sensores, capaces de detectar la amplitud y duración de las variaciones de la corriente iónica que pasa a través del poro. A medida que el ARN pasa a través del nanoporo, el bloqueo produce una interrupción en el flujo de corriente, que es diferente para las distintas bases, incluidas las modificadas, y por lo tanto puede utilizarse para identificar posibles modificaciones. Al producir lecturas de molécula única, sin amplificación previa del ARN ni conversión a ADNc, estas técnicas pueden conducir a la producción de mapas cuantitativos de todo el transcriptoma. [ 1 ] En particular, la tecnología de nanoporos demostró ser eficaz en la detección de la presencia de dos análogos de nucleótidos en el ARN: N 6 -metiladenosina (m6A) y 5-metilcitosina (5-mC). Utilizando modelos ocultos de Markov (HMM) o redes neuronales recurrentes (RNN) entrenadas con secuencias conocidas, fue posible demostrar que los nucleótidos modificados producen una interrupción característica en la corriente iónica al pasar a través del poro, y que estos datos pueden usarse para identificar el nucleótido. [ 1 ] [ 40 ]

Véase también

Referencias

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