Euglenoficina

La euglenoficina es un compuesto ictiotóxico aislado de Euglena sanguinea , una especie del género Euglena . Presenta actividad anticancerígena y herbicida in vitro . ^{[ 1 ]}

Se conocen muchas algas de agua dulce que producen toxinas, entre ellas las euglenoides (Euglenophyceae). Se ha descubierto que esta alga vive en ambientes de agua dulce en todo el mundo. Muchas euglenoides son heterótrofas , ya que se alimentan mediante fagocitosis o difusión simple. Sin embargo, un grupo monofilético de esta alga es mixótrofo , concretamente Rapaza viridis , lo que significa que alterna entre la fotosíntesis , la absorción de nutrientes y la fagocitosis de otros eucariotas . ^{[ 2 ]} Además, Eutreptiales y Euglenales son autótrofas, ya que contienen clorofila para realizar la fotosíntesis. Las euglenoides pueden contener clorofila y un pigmento accesorio , y/o astaxantina (un carotenoide ), debido a lo cual pueden ser de color verde o rojo. Aunque esta alga se descubrió relativamente pronto en la historia, los investigadores tardaron un tiempo en descubrir que produce la toxina euglenoficina, ya que no se habían identificado toxinas euglenoides en informes previos. Según investigaciones recientes, la euglenoficina se produce en al menos seis especies de algas euglenoides y en seis de las siete cepas de Euglena sanguinea . ^{[ 3 ]} Otros estudios se centran en la posible aplicación de la euglenoficina como fármaco anticancerígeno.

Debido a la compleja morfología de sus cloroplastos , descrita como un «sistema cromatóforo peculiar», la identificación de E. sanguinea mediante técnicas microscópicas sigue siendo un desafío. Por lo tanto, es necesario utilizar métodos basados ​​en datos moleculares para la verificación de la especie. ^{[ 6 ]}

En 2013, se desarrolló un análisis MS/MS para identificar y cuantificar los niveles de euglenoficina en cuerpos de agua dulce. Para crear los estándares experimentales para este análisis, la euglenoficina se purificó mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) a partir de cultivos clonales de E. sanguinea que se aislaron de los eventos de mortalidad en Carolina del Norte y Texas. ^{[ 4 ]} La figura 1A muestra el análisis espectrométrico de masas de la euglenoficina purificada (500  ng) y la figura 1B de la euglenoficina extraída de un cultivo de E. sanguinea. ^{[ 7 ]}

Para la detección específica de euglenoficina se desarrolló un método de monitorización de reacciones múltiples (MRM). Este método se basa en tres transiciones: m/z 288,3 a m/z 97,2, 110,2 y 136,2. De estas tres transiciones, se eligió m/z 110,2 como ion cuantificador, ya que era el ion producto más intenso. Las figuras 1C y 1D muestran la detección de 1  ng de euglenoficina. ^{[ 7 ]}

Otro método para monitorear estanques de agua dulce es la prueba de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En 2017, esta prueba se perfeccionó para detectar específicamente euglenoficina en aguas con floraciones de E. sanguinea . Esto se hizo con base en las secuencias de ADNr SSU significativamente largas encontradas en la especie de alga. ^{[ 6 ]} Al usar PCR anidada, se puede reducir la unión no específica debido a la amplificación de sitios de unión de cebadores inesperados. La especificidad de esta prueba se demostró con los resultados de PCR de especies estrechamente relacionadas con E. sanguinea. No se observaron productos en estas pruebas. Además, se puede obtener información adicional de la secuencia de nucleótidos, lo que permite examinar, clasificar y comparar la muestra.

En combinación con métodos de espectrometría de masas, las pruebas de PCR facilitan la monitorización y la evaluación de riesgos de las aguas dulces afectadas por floraciones tóxicas de E. sanguinea .

La euglenoficina producida por los euglenoides es una piperidina disustituida, ya que está constituida por un anillo de piperidina con una cadena lateral de butanol en la posición 6 y una cadena lateral de (1E,3E,7Z)-undeca-1,3,7-trieno en la posición 2. La cadena lateral en la posición 2 tiene un sistema conjugado que le confiere una absorbancia a 238 nm. Tanto la posición 2 como la 6 en el anillo de piperidina son centros quirales y, por lo tanto, su combinación determina la estereoisomería cis/trans del compuesto. Según el análisis de RMN tras la extracción, la mayor parte de la euglenoficina producida por los euglenoides se encuentra en la conformación cis con respecto a las posiciones 2 y 6. ^{[ 4 ]} Sin embargo, la estereoisomería cis/trans absoluta aún está por descubrirse. Además, cada doble enlace es un centro de estereoisomería E/Z, que en combinación con la estereoisomería cis/trans da lugar a un total de 12 estereoisómeros (en teoría). 

Aunque los átomos de nitrógeno y oxígeno pueden formar enlaces de hidrógeno, el compuesto es insoluble en agua y muy estable en disolventes orgánicos, lo que concuerda con su valor de log(p) predicho in silico de ~5,6. Cabe destacar que la estructura de la euglenoficina, a excepción de la cadena lateral de butanol, es extremadamente similar a la de la solenopsina , el principal componente del veneno de la hormiga roja. Por lo tanto, la vía de síntesis, la reactividad, las propiedades químicas y la toxicidad de estos compuestos también podrían ser similares. La eficacia de la solenopsina como fármaco anticancerígeno ha impulsado a los investigadores a estudiar el potencial de la euglenoficina para un fármaco similar. La sección «Mecanismos de acción» profundiza en este aspecto.

Es muy probable que la euglenoficina sea producida por enzimas conocidas como policétido sintasas (PKS), que se encuentran ampliamente en euglenoides, así como en otras algas que producen policétidos. ^{[ 2 ] [ 1 ]}

Estimaciones de rutas biosintéticas basadas en la similitud estructural

Aún se desconoce el mecanismo por el cual los euglenoides producen euglenoficina. Sin embargo, se pueden realizar estimaciones sobre esta vía debido a las similitudes estructurales de la euglenoficina con numerosos otros compuestos naturales, pero dichas estimaciones deben tomarse con suma cautela, ya que no están científicamente comprobadas.

Aunque la solenopsina producida por la hormiga roja de fuego presenta una gran similitud estructural con la euglenoficina, se desconoce si las vías de síntesis de estas toxinas también son similares, lo que podría ocurrir si se ha producido una evolución convergente de esta vía. ^{[ 4 ]}  

Curiosamente, Jeanne N. Tawara et al. (1993) investigaron los alcaloides tóxicos piperidinas de pinos (Pinus) y abetos (Picea), que son estructuralmente similares a la euglenoficina y que también son de origen policétido (Figura 2). ^{[ 8 ]}

Debido a esta notable similitud en ambas estructuras, excepto en la cadena lateral, y origen, es probable que la vía de síntesis de estos compuestos esté relacionada con la de la euglenoficina, teniendo en cuenta la relación evolutiva entre algas y árboles. ^{[ 9 ]} Lo mismo ocurre con la coniina, también conocida como «el asesino de Sócrates», que es otro compuesto que parece ser aún más similar a la euglenoficina y que ha sido investigado por Hannu Hotti y Heiko Rischer (Figura 3). ^{[ 10 ]}

Los investigadores de ambos grupos de compuestos similares a la euglenoficina han intentado dilucidar la ruta de síntesis. Las rutas de síntesis propuestas por ambos equipos de investigadores se superponen en gran medida y parecen ser complementarias. En primer lugar, se propone que el acetato se conjuga con la coenzima A para formar acetil-CoA. Este se convierte posteriormente en butiril-CoA y malonil-CoA, siendo la primera catalizada por la sintetasa de ácidos grasos (FAS). A continuación, una policétido sintasa acopla estos dos compuestos para formar un intermedio policétido, cuya estructura exacta aún no se ha confirmado (Figura 3). Este intermedio se reduce a un cetoácido y posteriormente a un cetoaldehído. La L-alanina aminotransferasa (AAT) convierte este último compuesto en un compuesto cetoamina que se cicla espontáneamente y se reduce a un compuesto de piperidina sustituida conocido como γ-coniceína (Figura 4).

Otras enzimas pueden catalizar la adición de diversas cadenas laterales a estas piperidinas, generando una variedad de compuestos basados ​​en piperidina (Figura 4). Los investigadores de las toxinas del pino y el abeto han propuesto una estructura para el intermedio policétido y han confirmado que las cadenas laterales de la piperidina se modifican tras la ciclación. Si bien la investigación aún no ha confirmado estas vías de síntesis con total certeza, se estima que los euglenoides emplean los mismos mecanismos para producir euglenoficina.

Antes de que se identificara la euglenoficina, los investigadores observaron que los peces expuestos a células de E. sanguinea presentaban síntomas de desorientación, aumento de la respiración e incapacidad para mantener el equilibrio. Estos peces también presentaban enrojecimiento del tejido branquial, pero no se observaron hemorragias. ^{[ 5 ]} Basándose en los cambios de comportamiento que acompañaban a estos síntomas, investigadores estadounidenses sugirieron que la toxina funciona como una neurotoxina. ^{[ 5 ]}

Los bagres inmaduros sometidos a pruebas con fracciones de algas, por Zimba et al. (2004), murieron a las 2 horas de la exposición. ^{[ 5 ]} Posteriormente, Zimba et al. (2009) confirmaron estas muertes cuando los bagres expuestos a euglenoficina purificada murieron a los 30 minutos de la exposición. ^{[ 4 ]}

Aunque la euglenoficina se produce en al menos otras seis especies de euglenoides, E. sanguinea parece ser la única que representa un problema significativo para la acuicultura y, por ende, para la economía. Esto se debe a que E. sanguinea forma floraciones tóxicas mucho más densas. ^{[ 11 ]}

Zimba et al. (2009) investigaron la toxicidad de la euglenoficina contra cinco especies de algas: Oocystis polymorpha, Gonphonema parvulum, Microcystis aeruginosa, Planktothrix PCC7811 y Scenedesmus dimorphus . La euglenoficina inhibió el crecimiento de las cinco especies y la inhibición fue significativa a concentraciones <300 ppb en todos los casos. ^{[ 4 ]}

Aunque la síntesis de euglenoficina aún no se comprende completamente, los experimentos demostraron que los euglenoides en cultivo producen euglenoficina independientemente de su estado de crecimiento. Esto podría indicar que la euglenoficina forma parte de un mecanismo de defensa de las algas. ^{[ 4 ]}

La euglenoficina se identificó hace relativamente poco tiempo, por lo que su mecanismo exacto aún no está claro. Sin embargo, la euglenoficina es estructuralmente muy similar a la solenopsina. La solenopsina se encuentra en el veneno de la hormiga roja y su mecanismo ha sido mucho más estudiado. Se espera que los mecanismos de la euglenoficina y la solenopsina también sean similares.

La investigación sobre la solenopsina y su mecanismo de acción constituye un importante primer indicio del mecanismo de la euglenoficina. Los estudios in vitro demostraron que la solenopsina tiene un efecto inhibidor sobre la vía PI3K/AKT, que forma parte de la vía mTOR en células de mamíferos. Esta vía interviene en diversos procesos celulares, como el crecimiento, la proliferación y la supervivencia celular, la síntesis de proteínas, la motilidad celular y la autofagia. ^{[ 12 ]}

Los estudios más recientes demostraron que la euglenoficina posee un gran potencial anticancerígeno. Esto podría deberse a la inhibición de la vía mTOR, ya que se sabe que esta vía, al estar hiperactivada, estimula significativamente las células cancerosas. Tanto la solenopsin como la euglenoficina son capaces de inhibir la proteína PI3K. La PI3K activa la AKT mediante fosforilación, lo que conlleva diversos efectos posteriores. Activa la vía mTOR, participa en la regulación metabólica y regula los inhibidores del ciclo celular. Permite la proliferación y reduce la apoptosis. Se encuentra hiperactiva en muchos tipos de cáncer. Sin embargo, esta vía es necesaria para promover el crecimiento y la diferenciación de las células madre adultas (a menudo neuronales). ^{[ 4 ]}

Los experimentos han demostrado que la euglenoficina también tiene efectos antiangiogénicos. La euglenoficina puede inhibir el VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular) y, por lo tanto, impedir la formación de nuevas venas que proporcionen oxígeno y nutrientes a los tumores en crecimiento. Cuando los tumores comienzan a crecer, necesitan oxígeno y nutrientes adicionales. Al interrumpir su suministro, se puede prevenir que los tumores crezcan y se diseminen a otras partes del cuerpo. ^{[ 13 ]}

Cabang et al. (2017) informaron que el efecto antiproliferativo de la euglenoficina se induce por su capacidad de poner a las células en la fase G1 del ciclo celular. ^{[ 14 ]} La detención del ciclo celular ocurre cuando se revisa una célula en el ciclo celular en busca de errores y se encuentra una falla. Las células necesitan duplicarse perfectamente; si esto no sucede, el ciclo celular se detiene y la célula no se duplica. Esto es para evitar que las células defectuosas crezcan en una persona sana.