Recombinación FLP-FRT

La proteína Flp, al igual que Cre, es una recombinasa sitio-específica de la familia de la tirosina. ^{[ 7 ]} Esta familia de recombinasas realiza su función a través de un mecanismo de topoisomerasa tipo IB que causa la recombinación de dos hebras separadas de ADN. ^{[ 7 ]} La recombinación se lleva a cabo mediante un proceso repetido de dos pasos. El paso inicial causa la creación de un intermedio de unión de Holliday . El segundo paso promueve la recombinación resultante de las dos hebras complementarias. Como sugiere su nombre de familia, un nucleófilo de tirosina altamente conservado escinde las hebras de ADN. ^{[ 7 ]} Las propiedades nucleofílicas de la tirosina atacan y se unen al fosfato 3' en el punto de escisión del ADN. ^{[ 7 ]} El grupo hidroxilo 5' resultante del ADN escindido actúa como nucleófilo y ataca el fosfato 3' en la hebra de ADN escindida complementariamente, lo que resulta en una recombinación exitosa. ^{[ 7 ]} Fuera del residuo de tirosina, hay una pentada catalítica conservada. Esta pentada está compuesta por una lisina (Lysβ), dos argininas (Arg I y II), una histidina (His-II) y una histidina/triptófano (His/Trp-III) que comprende una constelación de residuos obligatoria y altamente conservada para el sitio activo de Flp y Cre (junto con otras topoisomerasas IB). ^{[ 7 ]} Estos otros residuos son cruciales para la correcta orientación de la unión de Flp y su posicionamiento en las hebras de ADN.

El mosaicismo genético se produce en un organismo cuando tipos celulares similares expresan fenotipos diferentes debido a genotipos distintos en loci específicos. En pocas palabras, esto ocurre cuando un organismo contiene genotipos diferentes, lo cual suele ser raro en la naturaleza. Sin embargo, esto puede producirse fácilmente (y de forma problemática) mediante la recombinación FLP-FRT. Si hay dos sitios FRT diferentes en una célula y FLP está presente en concentraciones adecuadas, el casete FRT se seguirá escindiendo e insertando entre los dos sitios FRT. Este proceso continuará hasta que las proteínas FLP disminuyan por debajo de las concentraciones requeridas, lo que dará lugar a células dentro de un organismo con genotipos diferentes. ^{[ 9 ]} Esto se ha observado desde moscas de la fruta hasta ratones y no discrimina entre cromosomas específicos (somáticos y sexuales) o tipos celulares (somáticos y germinales). ^{[ 9 ] [ 10 ]}

Antes de la publicación de Dymecki et al . (1998), la recombinasa Cre se había utilizado para el mapeo del destino celular de progenitores neuronales en ratones utilizando el promotor En2 . ^{[ 11 ]} Por lo tanto, los autores de Dymecki et al . (1998) teorizaron que la recombinasa FLP podría utilizarse de manera similar con una eficacia similar a la de la recombinasa Cre en ratones. Los autores crearon dos líneas de ratones transgénicos: una línea de fusión neuronal Wnt1::Flp y una línea que poseía el casete FRT flanqueando el exón 18 de tm1Cwr . ^{[ 9 ]} Los autores eligieron este exón para la escisión porque si se escinde, da como resultado un fenotipo nulo. Los autores cruzaron las dos líneas y permitieron que la progenie alcanzara la edad adulta antes de sacrificarla. Se realizó la extracción de ARN en tejido neuronal, muscular, entérico y de la cola. La PCR de transcripción inversa y la transferencia Northern confirmaron la escisión del exón 18 de tm1Cwr de forma abundante en el tejido cerebral y moderada en el tejido muscular (debido a las células de Schwann presentes en el músculo). Como era de esperar, no se observó escisión en otros tejidos. Los autores observaron una eficiencia igual, o incluso superior, de la recombinasa FLP en la determinación del destino celular en comparación con la recombinasa Cre.

Hasta la fecha, la recombinasa Flp se ha utilizado muchas veces en D. melanogaster. Una comparación de la recombinasa Flp con la recombinasa Cre en D. melanogaster fue publicada por Frickenhaus et al. (2015) ^{[ 12 ]} . Los autores de Frickenhaus et al. (2015) tenían un objetivo doble: caracterizar y comparar la eficacia de la "eliminación" de la recombinasa Flp con la "eliminación" de la recombinasa Cre y el silenciamiento por RNAi y revelar la función de cabeza (caz), el ortólogo de la mosca de FUS , en las neuronas y el tejido muscular de D. melanogaster . FUS ha sido fuertemente implicado en la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y la demencia frontotemporal en humanos ^{[ 12 ]} . Los autores utilizaron un sistema elav - Gal4/UAS -Flp o Cre para expresar la recombinasa específicamente en neuronas y un sistema Mef2 -Gal4/UAS-Flp o Cre para expresarla específicamente en músculos. ^{[ 12 ]} Los autores concluyen que la herramienta de "eliminación" de la recombinasa Flp es más eficaz que la recombinasa Cre y la de ARN de interferencia (ARNi) para la eliminación de genes específicos en tejidos o líneas celulares específicas, debido a la ausencia de la expresión basal observada tanto en la proteína Cre como en el transcrito de ARNi. Además, los autores observaron una toxicidad en la proteína Cre que no se observa con la proteína Flp. ^{[ 12 ]}

La eficacia del sistema de recombinasa FLPe fue evaluada en pez cebra por Wong et al. (2009). ^{[ 13 ]} Se inyectó la proteína FLPe a embriones hemicigotos para una proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) flanqueada por FRT, aguas abajo de un promotor específico de músculo. Sin FLPe, estos embriones deberían expresar EGFP en todo el tejido muscular, y si se cruzan con una cepa de tipo silvestre, el 50% de la progenie resultante también debería expresar EGFP en el tejido muscular. Los embriones inyectados con FLPe mostraron una expresión significativamente reducida de EGFP en el tejido muscular, y también se observó mosaicismo. ^{[ 13 ]} Cuando estos embriones alcanzaron la edad adulta, se cruzaron con una cepa de tipo silvestre, y las puestas resultantes tuvieron una progenie significativamente menor que expresaba EGFP en el tejido muscular (0-4%). ^{[ 13 ]} Estos resultados muestran que FLPe no solo es altamente eficaz en células somáticas, sino que también es altamente eficaz en la línea germinal del pez cebra.