Fijación (histología)

La fijación por calor se utiliza para la fijación de organismos unicelulares, principalmente bacterias y arqueas . Los organismos se mezclan típicamente con agua o solución salina fisiológica, lo que ayuda a extender la muestra de manera uniforme. Una vez diluida, la muestra se extiende sobre un portaobjetos . Esta muestra bacteriana diluida se conoce comúnmente como frotis después de colocarla en el portaobjetos. Después de que el frotis se haya secado a temperatura ambiente, el portaobjetos se sujeta con pinzas o una pinza de ropa y se pasa varias veces por la llama de un mechero Bunsen para inactivar el calor y adherir el organismo al portaobjetos. También se puede utilizar un dispositivo de microincineración . Después del calentamiento, las muestras generalmente se tiñen y luego se observan con un microscopio. ^{[ 4 ]} La fijación por calor generalmente conserva la morfología general, pero no las estructuras internas. El calor desnaturaliza la enzima proteolítica e impide la autólisis. La fijación por calor no se puede utilizar en el método de tinción capsular, ya que la fijación por calor encoge o destruye la cápsula ( glicocálix ) y no se puede observar en las tinciones. ^{[ 5 ]}

La inmersión se puede utilizar para fijar muestras histológicas, desde una sola célula hasta un organismo completo. La muestra de tejido se sumerge en una solución fijadora durante un tiempo determinado. El volumen de la solución fijadora debe ser al menos 10 veces mayor que el del tejido. ^{[ 6 ]} Para que la fijación sea exitosa, el fijador debe difundirse por todo el tejido, por lo que se deben considerar el tamaño y la densidad del tejido, así como el tipo de fijador. Esta es una técnica común para aplicaciones celulares, pero también se puede utilizar para tejidos más grandes. El uso de una muestra más grande implica que debe sumergirse durante más tiempo para que el fijador alcance el tejido más profundo. ^{[ 7 ]}

La perfusión es el paso de fluido a través de los vasos sanguíneos o canales naturales de un órgano u organismo. En la fijación de tejidos por perfusión, el fijador se bombea al sistema circulatorio, generalmente a través de una aguja insertada en el ventrículo izquierdo . Esto se puede hacer mediante guía ecográfica o abriendo la cavidad torácica del sujeto. ^{[ 8 ]} El fijador se inyecta en el corazón con un volumen de inyección que coincide con el gasto cardíaco típico. Utilizando el sistema circulatorio innato, el fijador se distribuye por todo el cuerpo y el tejido no muere hasta que se fija. Cuando se utiliza este método, también se debe agregar un puerto de drenaje en algún lugar del sistema circulatorio para tener en cuenta el volumen adicional del fijador y el tampón; esto generalmente se hace en la aurícula derecha . El fijador se bombea al sistema circulatorio hasta que haya reemplazado toda la sangre. El uso de la perfusión tiene la ventaja de preservar la morfología, ^{[ 9 ]} pero las desventajas son que el sujeto muere y el volumen de fijador necesario para organismos más grandes es alto, lo que puede aumentar los costos. Es posible disminuir el volumen de líquido necesario para realizar una fijación por perfusión mediante la oclusión de las arterias que irrigan tejidos que no son de interés para la investigación en cuestión. La fijación por perfusión se utiliza comúnmente para obtener imágenes de tejidos cerebrales, pulmonares y renales en roedores, y también se emplea en la realización de autopsias en humanos. ^{[ 7 ] [ 10 ]}

Los fijadores de reticulación actúan creando enlaces químicos covalentes entre las proteínas del tejido. Esto ancla las proteínas solubles al citoesqueleto y confiere mayor rigidez al tejido. La preservación de estructuras citoesqueléticas transitorias o finas, como las contracciones durante las ondas de diferenciación embrionaria, se logra mejor mediante un pretratamiento con microondas antes de la adición del fijador de reticulación. ^{[ 11 ] [ 12 ]}

El fijador más utilizado en histología es el formaldehído . Generalmente se emplea como formalina tamponada neutra (NBF) al 10%, es decir, aproximadamente entre un 3,7% y un 4,0% de formaldehído en tampón fosfato, pH 7. Dado que el formaldehído es un gas a temperatura ambiente, se utiliza formalina (formaldehído gaseoso disuelto en agua al 37% p/v)) para preparar el primer fijador. El formaldehído fija el tejido mediante la reticulación de las proteínas, principalmente los residuos del aminoácido básico lisina . Sus efectos son reversibles con un exceso de agua y evita la pigmentación por formalina. El paraformaldehído también se utiliza comúnmente y se despolimeriza a formalina al calentarse, lo que lo convierte en un fijador eficaz. Otras ventajas del paraformaldehído incluyen su larga vida útil y su buena penetración en los tejidos. Es especialmente útil para técnicas de inmunohistoquímica. El vapor de formaldehído también puede utilizarse como fijador para frotis celulares.

Otro aldehído popular para la fijación es el glutaraldehído . Actúa de forma similar al formaldehído, provocando la deformación de las hélices α de las proteínas. Sin embargo, el glutaraldehído es una molécula más grande que el formaldehído, por lo que penetra las membranas más lentamente. En consecuencia, la fijación con glutaraldehído en muestras de tejido más gruesas puede resultar difícil; esto se puede solucionar reduciendo el tamaño de la muestra. Una de las ventajas de la fijación con glutaraldehído es que puede ofrecer un producto fijado más rígido o con enlaces más fuertes : su mayor longitud y sus dos grupos aldehído le permiten "unir" y enlazar pares de moléculas de proteína más distantes. Provoca cambios rápidos e irreversibles, es muy adecuado para la microscopía electrónica, funciona bien a 4  °C y proporciona el mejor detalle general del citoplasma y el núcleo. Sin embargo, no es ideal para la tinción inmunohistoquímica.

Algunos protocolos de fijación requieren una combinación de formaldehído y glutaraldehído para que sus respectivas concentraciones se complementen entre sí.

Estos fijadores de reticulación, especialmente el formaldehído, tienden a preservar la estructura secundaria de las proteínas y también pueden preservar la mayor parte de la estructura terciaria .

Los fijadores precipitantes (o desnaturalizantes ) actúan reduciendo la solubilidad de las moléculas de proteína y, a menudo, alterando las interacciones hidrofóbicas que confieren a muchas proteínas su estructura terciaria. La precipitación y agregación de proteínas es un proceso muy diferente de la reticulación que se produce con los fijadores aldehídicos.

Los fijadores precipitantes más comunes son el etanol y el metanol . Se utilizan habitualmente para fijar cortes congelados y frotis. También se utiliza la acetona , la cual ha demostrado producir una mejor conservación histológica que los cortes congelados cuando se emplea en la técnica de acetona, metilbenzoato y xileno (AMEX).

El metanol, el etanol y la acetona, agentes desnaturalizantes de proteínas, rara vez se utilizan solos para fijar bloques, salvo en el caso de estudios sobre ácidos nucleicos.

El ácido acético es un desnaturalizante que a veces se usa en combinación con otros fijadores precipitantes, como el AFA de Davidson. ^{[ 13 ]} Se sabe que los alcoholes, por sí solos, causan una contracción y endurecimiento considerables del tejido durante la fijación, mientras que el ácido acético solo se asocia con hinchazón del tejido; la combinación de ambos puede resultar en una mejor preservación de la morfología del tejido .

Los fijadores oxidantes pueden reaccionar con las cadenas laterales de las proteínas y otras biomoléculas, lo que permite la formación de enlaces cruzados que estabilizan la estructura tisular. Sin embargo, provocan una desnaturalización extensa a pesar de preservar la estructura celular fina y se utilizan principalmente como fijadores secundarios.

El tetróxido de osmio se usa frecuentemente como fijador secundario al preparar muestras para microscopía electrónica . (No se usa para microscopía óptica, ya que penetra muy mal en secciones gruesas de tejido).

El dicromato de potasio , el ácido crómico y el permanganato de potasio se utilizan en ciertas preparaciones histológicas específicas.

Los fijadores de mercurio, como el B-5 y el fijador de Zenker, poseen un mecanismo desconocido que aumenta la intensidad de la tinción y proporciona una excelente nitidez nuclear. A pesar de su rápida acción, penetran poco y provocan retracción tisular. Su mejor aplicación es la fijación de tejidos hematopoyéticos y reticuloendoteliales. Cabe destacar que, al contener mercurio, se debe tener especial cuidado al desecharlos.

Los picratos penetran bien en los tejidos y reaccionan con las histonas y las proteínas básicas para formar picratos cristalinos con aminoácidos, precipitando así todas las proteínas. Es un buen fijador para el tejido conectivo, conserva bien el glucógeno y extrae los lípidos, lo que proporciona resultados superiores al formaldehído en la inmunotinción de hormonas biogénicas y polipeptídicas. Sin embargo, provoca la pérdida de basófilos a menos que la muestra se lave a fondo después de la fijación.

El efecto de protección contra disolventes orgánicos mediado por el tampón de ácido glutámico-Hepes (HOPE) proporciona una morfología similar a la del formaldehído, una excelente conservación de los antígenos proteicos para la inmunohistoquímica y la histoquímica enzimática, buenos rendimientos de ARN y ADN y ausencia de proteínas reticuladas.