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microscopía de imágenes de tiempo de vida de fluorescencia

La microscopía de imagen de tiempo de vida de fluorescencia ( FLIM) es una técnica de imagen basada en las diferencias en la tasa de decaimiento exponencial de la emisión de fot...

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La microscopía de imagen de tiempo de vida de fluorescencia ( FLIM) es una técnica de imagen basada en las diferencias en la tasa de decaimiento exponencial de la emisión de fotones de un fluoróforo de una muestra. Se puede utilizar como técnica de imagen en microscopía confocal , microscopía de excitación de dos fotones y tomografía multifotónica.

La vida media de fluorescencia (FLT) del fluoróforo, en lugar de su intensidad, se utiliza para crear la imagen en FLIM. La vida media de fluorescencia depende del microambiente local del fluoróforo, lo que evita mediciones erróneas de la intensidad de fluorescencia debidas a cambios en el brillo de la fuente de luz, la intensidad de la luz de fondo o el fotoblanqueo limitado. Esta técnica también tiene la ventaja de minimizar el efecto de la dispersión de fotones en capas gruesas de muestra. Al depender del microambiente, las mediciones de vida media se han utilizado como indicador de pH , [ 1 ] viscosidad [ 2 ] y concentración de especies químicas . [ 3 ] [ 4 ]

Tiempos de vida de la fluorescencia

Un fluoróforo excitado por un fotón volverá al estado fundamental con una cierta probabilidad basada en las tasas de decaimiento a través de varias vías de decaimiento diferentes (radiativas y/o no radiativas). Para observar fluorescencia, una de estas vías debe ser la emisión espontánea de un fotón. En la descripción del conjunto , la fluorescencia emitida decaerá con el tiempo según

I(t)=I0mi−t/τ{\displaystyle I(t)=I_{0}e^{-t/\tau }}

dónde

1τ=∑ki{\displaystyle {\frac {1}{\tau }}=\sum k_{i}}.

En lo anterior,t{\displaystyle t}es el tiempo,τ{\displaystyle \tau }es el tiempo de vida de la fluorescencia,I0{\displaystyle I_{0}}es la fluorescencia inicial ent=0{\displaystyle t=0}, yki{\displaystyle k_{i}}son las tasas para cada vía de decaimiento, al menos una de las cuales debe ser la tasa de decaimiento de fluorescencia.kF{\displaystyle k_{f}}. Más importante aún, la vida,τ{\displaystyle \tau }es independiente de la intensidad inicial y de la luz emitida. Esto puede utilizarse para realizar mediciones no basadas en la intensidad en la detección química. [ 5 ]

Medición

La obtención de imágenes de tiempo de vida de fluorescencia produce imágenes con la intensidad de cada píxel determinada porτ{\displaystyle \tau }, que permite ver el contraste entre materiales con diferentes tasas de decaimiento de fluorescencia (incluso si esos materiales fluorescen exactamente a la misma longitud de onda), y también produce imágenes que muestran cambios en otras vías de decaimiento, como en la imagen FRET .

Iluminación pulsada

La vida media de la fluorescencia se puede determinar en el dominio del tiempo mediante una fuente pulsada. Cuando una población de fluoróforos se excita con un pulso de luz ultracorto o delta , la fluorescencia resuelta en el tiempo decaerá exponencialmente, como se describió anteriormente. Sin embargo, si el pulso de excitación o la respuesta de detección son amplios, la fluorescencia medida, d(t), no será puramente exponencial. La función de respuesta instrumental, IRF(t), se convolucionará o se combinará con la función de decaimiento, F(t).

d(t)=IRF(t)⊗F(t){\displaystyle {d}(t)={IRF}(t)\otimes {F}(t)}

La respuesta instrumental de la fuente, el detector y la electrónica se puede medir, generalmente a partir de la luz de excitación dispersa. Recuperar la función de decaimiento (y las vidas medias correspondientes) plantea desafíos adicionales, ya que la división en el dominio de la frecuencia tiende a producir un ruido elevado cuando el denominador es cercano a cero.

TCSPC

El conteo de fotones individuales correlacionados en el tiempo ( TCSPC ) se emplea habitualmente porque compensa las variaciones en la intensidad de la fuente y las amplitudes de los pulsos de fotones individuales. Utilizando equipos TCSPC comerciales, se puede registrar una curva de decaimiento de fluorescencia con una resolución temporal de hasta 405  fs. [ 6 ] El histograma de decaimiento de fluorescencia registrado obedece a la estadística de Poisson , que se considera para determinar la bondad del ajuste durante el proceso. Más específicamente, TCSPC registra los tiempos en los que fotones individuales son detectados por un detector rápido de fotones individuales (típicamente un tubo fotomultiplicador ( PMT ) o un fotodiodo de avalancha de fotones individuales (SPAD)) con respecto al pulso láser de excitación. Los registros se repiten para múltiples pulsos láser y, tras un número suficiente de eventos registrados, se puede construir un histograma del número de eventos en todos estos puntos temporales registrados. Este histograma se puede ajustar a una función exponencial que contiene la función de decaimiento exponencial de la vida media de interés, y el parámetro de vida media se puede extraer en consecuencia. Los sistemas PMT multicanal con 16 [ 7 ] a 64 elementos han estado disponibles comercialmente, mientras que los sistemas FLIM de diodo de avalancha de fotón único (SPAD)-TCSPC CMOS demostrados recientemente pueden ofrecer un número aún mayor de canales de detección y opciones adicionales de bajo costo. [ 8 ]

Método de compuerta

La excitación por pulsos todavía se utiliza en este método. Antes de que el pulso llegue a la muestra, parte de la luz se refleja en un espejo dicroico y es detectada por un fotodiodo que activa un generador de retardo que controla un intensificador óptico con compuerta (GOI) situado delante del detector CCD. El GOI solo permite la detección durante la fracción de tiempo en que está abierto después del retardo. Así, con un generador de retardo ajustable, se puede recoger la emisión de fluorescencia después de múltiples tiempos de retardo que abarcan el rango de tiempo de la desintegración de la fluorescencia de la muestra. [ 9 ] [ 10 ] En los últimos años, las cámaras CCD intensificadas integradas han entrado en el mercado. Estas cámaras constan de un intensificador de imagen, un sensor CCD y un generador de retardo integrado. Las cámaras ICCD con tiempos de compuerta más cortos de hasta 200 ps y pasos de retardo de 10 ps permiten FLIM con resolución subnanosegundo. En combinación con un endoscopio, esta técnica se utiliza para el diagnóstico intraoperatorio de tumores cerebrales. [ 11 ]

Modulación de fase

La vida media de la fluorescencia se puede determinar en el dominio de la frecuencia mediante un método de modulación de fase. Este método utiliza una fuente de luz pulsada o modulada a alta frecuencia (hasta 500  MHz), como un LED, un láser de diodo o una fuente de onda continua , combinada con un modulador electroóptico o un modulador acustoóptico . La fluorescencia se (a) demodula y (b) desfasa; ambas magnitudes están relacionadas con los tiempos de decaimiento característicos del fluoróforo. Además, las componentes y de las ondas sinusoidales de excitación y fluorescencia se modulan, y la vida media se puede determinar a partir de la relación de modulación de estas componentes y. Por lo tanto, se pueden determinar 2 valores para la vida media mediante el método de modulación de fase. Las vidas medias se determinan mediante un procedimiento de ajuste de estos parámetros experimentales. Una ventaja de la FLIM en el dominio de la frecuencia basada en PMT o en cámara es su rápida adquisición de imágenes de vida media, lo que la hace adecuada para aplicaciones como la investigación de células vivas. [ 12 ]

Análisis

El objetivo del algoritmo de análisis es extraer la curva de decaimiento puro a partir del decaimiento medido y estimar la(s) vida(s). Esto último se suele lograr ajustando funciones exponenciales simples o múltiples. Se han desarrollado diversos métodos para resolver este problema. La técnica más utilizada es la reconvolución iterativa de mínimos cuadrados, que se basa en la minimización de la suma ponderada de los residuos. En esta técnica, las curvas teóricas de decaimiento exponencial se convolucionan con la función de respuesta del instrumento, que se mide por separado, y el mejor ajuste se encuentra mediante el cálculo iterativo de los residuos para diferentes entradas hasta encontrar un mínimo. Para un conjunto de observacionesd(ti){\displaystyle d({{t}_{i}})} de la señal de fluorescencia en el intervalo de tiempo i, la estimación de la vida útil se lleva a cabo minimizando:

χ2=∑i[di(ti)−d0i(ti,a,τ)]2{\displaystyle {{\chi }^{2}}=\sum \limits _{i}{{\left[{{d}_{i}}({{t}_{i}})-{{d}_{0i}}({{t}_{i}},a,\tau )\right]}^{2}}}

Además de las dificultades experimentales, incluida la función de respuesta del instrumento dependiente de la longitud de onda, el tratamiento matemático del problema de la deconvolución iterativa no es sencillo y es un proceso lento que, en los inicios de FLIM, lo hizo poco práctico para un análisis píxel a píxel. Los métodos sin ajuste son atractivos porque ofrecen una solución muy rápida para la estimación de la vida útil. Una de las técnicas principales y más sencillas de esta categoría es el método de determinación rápida de la vida útil (RLD). El RLD calcula las vidas útiles y sus amplitudes directamente dividiendo la curva de decaimiento en dos partes de igual ancho. δ{\displaystyle \delta }t. El análisis se realiza integrando la curva de decaimiento en intervalos de tiempo iguales.δ{\displaystyle \delta }t:

D0=∑i=1K/2IiδtD1=∑i=K/2KIiδt{\displaystyle {\begin{matrix}{{D}_{0}}=\sum \limits _{i=1}^{K/2}{{{I}_{i}}\delta t}&{{D}_{1}}=\sum \limits _{i=K/2}^{K}{{{I}_{i}}\delta t}\\\end{matrix}}}

Ii es la señal registrada en el i-ésimo canal y K es el número de canales. La vida útil se puede estimar utilizando:

τ=δt/ln⁡(D0/D1){\displaystyle \tau =\delta t/\ln({{D}_{0}}/{{D}_{1}})}

Para decaimientos multiexponenciales, esta ecuación proporciona la vida media. Este método puede extenderse para analizar decaimientos biexponenciales. Una desventaja importante de este método es que no considera el efecto de la respuesta del instrumento, por lo que la parte inicial de las curvas de decaimiento medidas debe ignorarse en los análisis. Esto implica que se descarta parte de la señal y disminuye la precisión para estimar vidas medias cortas.

Una de las características interesantes del teorema de convolución es que la integral de la convolución es el producto de los factores que la componen. Existen algunas técnicas que operan en el espacio transformado y que aprovechan esta propiedad para recuperar la curva de decaimiento pura a partir de la curva medida. La transformada de Laplace y la de Fourier, junto con la expansión de Laguerre-Gauss, se han utilizado para estimar la vida útil en el espacio transformado. Estos enfoques son más rápidos que los métodos basados ​​en la deconvolución, pero presentan problemas de truncamiento y muestreo. Además, la aplicación de métodos como la expansión de Laguerre-Gauss es matemáticamente compleja. En los métodos de Fourier, la vida útil de una curva de decaimiento exponencial simple viene dada por:

τ=1norteωAnorteBnorte{\displaystyle \tau ={\frac {1}{n\omega }}{\frac {{A}_{n}}{{B}_{n}}}}

Dónde:

Anorte=∑td(t)pecado⁡(norteωt)∑tIRF(t)pecado⁡(norteωt)=ωτ1+ω2τ2,Bnorte=∑td(t)porque⁡(norteωt)∑tIRFporque⁡(norteωt)=11+norteω2τ2,ω=2πT{\displaystyle {\begin{matrix}{{A}_{n}}={\frac {\sum \limits _{t}{d(t)\sin(n\omega t)}}{\sum \limits _{t}{IRF(t)\sin(n\omega t)}}}={\frac {\omega \tau }{1+{{\omega }^{2}}{{\tau }^{2}}}},&{{B}_{n}}={\frac {\sum \limits _{t}{d(t)\cos(n\omega t)}}{\sum \limits _{t}{IRF\cos(n\omega t)}}}={\frac {1}{1+n{{\omega }^{2}}{{\tau }^{2}}}},&\omega ={\frac {2\pi }{T}}\\\end{matrix}}}

donde n es el número armónico y T es el intervalo de tiempo total de detección.

Aplicaciones

FLIM se ha utilizado principalmente en biología como método para detectar fotosensibilizadores en células y tumores, así como FRET en casos donde la imagen ratiométrica es difícil. La técnica se desarrolló a finales de la década de 1980 y principios de la de 1990 (Método de compuerta: Bugiel et al. 1989. König 1989, [ 13 ] Modulación de fase: Lakowicz et al. 1992, [ 14 ] [ 15 ] ) antes de ser aplicada más ampliamente a finales de la década de 1990. En cultivo celular, se ha utilizado para estudiar la señalización del receptor de EGF [ 16 ] y el tráfico. [ 17 ] FLIM de dominio temporal (tdFLIM) también se ha utilizado para mostrar la interacción de ambos tipos de proteínas de filamentos intermedios nucleares lamininas A y B1 en homopolímeros distintos en la envoltura nuclear, que a su vez interactúan entre sí en estructuras de orden superior. [ 18 ] La imagen FLIM es particularmente útil en neuronas, donde la dispersión de la luz por el tejido cerebral es problemática para la imagen ratiométrica. [ 19 ] En neuronas, la imagen FLIM con iluminación pulsada se ha utilizado para estudiar las proteínas de la familia Ras , [ 20 ] CaMKII , Rac y Ran [ 21 ] . FLIM se ha utilizado en tomografía multifotónica clínica para detectar células cancerosas intradérmicas, así como compuestos farmacéuticos y cosméticos.

Más recientemente, FLIM también se ha utilizado para detectar flavanoles en células vegetales. [ 22 ]

Coenzimas autofluorescentes NAD(P)H y FAD

La microscopía de fluorescencia multifotónica (FLIM) se utiliza cada vez más para detectar la autofluorescencia de las coenzimas como marcadores de cambios en el metabolismo de los mamíferos. [ 23 ] [ 24 ]

Imágenes FRET

Dado que la vida media de fluorescencia de un fluoróforo depende tanto de procesos radiativos (es decir, fluorescencia) como no radiativos (es decir, extinción, FRET), la transferencia de energía de la molécula donante a la molécula aceptora disminuirá la vida media del donante. Por lo tanto, las mediciones FRET mediante FLIM pueden proporcionar un método para discriminar entre los estados/entornos del fluoróforo. [ 25 ] A diferencia de las mediciones FRET basadas en intensidad, las mediciones FRET basadas en FLIM también son insensibles a la concentración de fluoróforos y, por lo tanto, pueden filtrar los artefactos introducidos por variaciones en la concentración y la intensidad de emisión en toda la muestra.

Véase también

Referencias

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  • Imágenes de tiempo de vida del estado excitado de fluorescencia
  • Herramientas de análisis espectral y de tiempo de vida en ImageJ: http://spechron.com Archivado el 11 de marzo de 2013 en Wayback Machine
  • Microscopía de imágenes de tiempo de vida de fluorescencia
  • Principio de TCSPC FLIM (Becker&Hickl GmbH)