Frecuencia (gen)

El gen frequency ( frq ) codifica la proteína frequency (FRQ) que funciona en el reloj circadiano de Neurospora crassa . La proteína FRQ desempeña un papel clave en el oscilador circadiano, sirviendo para nuclear el complejo del elemento negativo en el bucle de retroalimentación negativa de transcripción-traducción autorregulado (TTFL) que es responsable de los ritmos circadianos en N. crassa . ^{[ 1 ]} Ritmos similares se encuentran en mamíferos, Drosophila y cianobacterias. Recientemente, se han identificado homólogos de FRQ en varias otras especies de hongos. ^{[ 2 ]} La expresión de frq está controlada por los dos factores de transcripción white collar-1 (WC-1) y white collar-2 (WC-2) que actúan juntos como el Complejo White Collar (WCC) y sirven como el elemento positivo en el TTFL. La expresión de frq también puede ser inducida por exposición a la luz de manera dependiente de WCC. La genética directa ha generado muchos alelos de frq que resultan en cepas cuyos relojes circadianos varían en la duración del período.

El locus frq fue descubierto por Jerry F. Feldman. Feldman había sido estudiante de posgrado con Colin Pittendrigh en Princeton y fue a Caltech en 1967 para comenzar cribados genéticos de mutantes del reloj circadiano. El cribado fue ayudado por trabajos recientes que mejoraron la expresión del ritmo en Neurospora . Colin Pittendrigh y sus colegas habían confirmado en 1959 que el ciclo diario de desarrollo asexual, descrito en Neurospora crassa anteriormente por Brandt, ^{[ 3 ]} se debía de hecho a la regulación por un reloj circadiano . ^{[ 4 ]} En un trabajo publicado poco antes de que Feldman llegara a Caltech, Malcolm L. Sargent, Winslow R. Briggs y Dow O. Woodward en la Universidad de Stanford informaron que la expresión manifiesta del ritmo de desarrollo en la conidiación estaba mejorada en una cepa de Neurospora llamada Timex. ^{[ 5 ]} (Esta cepa contenía una mutación en la banda del locus (bd) , que posteriormente se demostró que codificaba un alelo ligeramente hiperactivo de ras-1 , por lo que las cepas ahora se conocen como ras-1[bd] . ^{[ 6 ]} Debido a que los ritmos en las cepas que incluyen ras-1[bd] son ​​más fáciles de detectar, ras-1[bd] se incorpora a menudo en las cepas utilizadas para estudios de biología circadiana en Neurospora . ^{[ 6 ]} ). Los resultados del reloj circadiano de Neurospora incluyen la síntesis de carotenoides , así como la formación de esporas asexuales observada en los tubos de cultivo, y evidencia reciente sugiere que miles de genes están bajo control circadiano. ^{[ 7 ] [ 2 ]}

Feldman utilizó nitrosoguanidina como mutágeno y tubos de cultivo para examinar cepas individuales que sobrevivieron a la mutagénesis para determinar la duración de su período circadiano. Los tubos de cultivo son tubos de vidrio largos y huecos doblados en ambos extremos para contener un medio de cultivo de agar . Cuando Neurospora se inocula en un extremo de un tubo, crecerá hasta el otro extremo, y en oscuridad constante se manifiesta el ciclo circadiano diario de crecimiento y desarrollo. ^{[ 8 ]} Aunque las pruebas de Feldman fueron exitosas, tardó en publicar, por lo que la identidad de los genes mutantes frq [1], frq [2] y frq [3] no se informó hasta 1973. ^{[ 9 ]} En 1986, frq fue clonado por Jay Dunlap y sus colegas utilizando una estrategia que implicaba un largo paseo cromosómico y la aplicación exitosa de la estrategia entonces no probada de rescatar un mutante de comportamiento arrítmico a través de la transformación de ADN exógeno derivado del paseo cromosómico. El éxito de esta estrategia y de la clonación de un gen del reloj despertó interés en una mayor investigación y comprensión del reloj circadiano de N. crassa . ^{[ 10 ]} Posteriormente se demostró que la expresión de frq presentaba un ciclo rítmico; además, cuando se diseñaron cepas de Neurospora en las que la expresión de frq podía ser impulsada desde una región distinta del gen silvestre residente , se descubrió que FRQ reprimía su propia expresión y que ningún nivel de expresión constante podía sustentar un reloj circadiano. ^{[ 11 ]} Estos experimentos fueron los primeros en manipular la expresión de un gen del reloj mediante medios que no afectaban directamente al reloj y establecieron que la retroalimentación negativa autorregulatoria que da lugar a la expresión cíclica del gen del reloj se encuentra en el núcleo del oscilador circadiano.

Como reflejo de su función como proteína central del reloj biológico, la eliminación del gen frq produce arritmia, y en Neurospora , la única función de FRQ es en el reloj circadiano. El gen frq puede activarse a partir de dos secuencias cis-reguladoras distintas en su promotor: un sitio distal, la caja del reloj, utilizada en el contexto de la regulación circadiana, y un sitio cercano al sitio principal de inicio de la transcripción que se utiliza para la expresión inducida por la luz (el elemento regulador proximal de la luz o PLRE). Ambos transcritos de frq tienen la capacidad de codificar dos proteínas FRQ: una forma larga de 989 aminoácidos (lFRQ) y una forma corta de 890 aminoácidos (sFRQ). Tanto lFRQ como sFRQ son necesarias para una ritmicidad fuerte, aunque el reloj puede persistir a ciertas temperaturas, si bien con una ritmicidad más débil, con solo una de las proteínas presente. ^{[ 13 ]} La elección de qué proteína se produce es el resultado del empalme dependiente de la temperatura del transcrito primario, de modo que incluye o excluye el codón de inicio ATG para lFRQ. ^{[ 14 ]} Las dos formas de FRQ proporcionan al reloj de Neurospora un mayor rango de temperaturas en el que puede operar de forma óptima. Un aumento de la temperatura conduce a una mayor expresión de lFRQ, mientras que sFRQ no se ve afectado. Las temperaturas más cálidas inducen un empalme más eficiente de un intrón en el sitio de inicio de la traducción. ^{[ 7 ]} Debido a que sFRQ favorece un período más largo que lFRQ, los ritmos de libre oscilación en Neurospora de tipo silvestre se reducen ligeramente con el aumento de la temperatura. ^{[ 7 ]}

También se ha demostrado que FRQ interactúa con varias otras proteínas. Interactúa en todo momento con FRH ( helicasa de ARN que interactúa con FRQ ; una helicasa de ARN esencial que contiene una caja DEAD en Neurospora ) para formar un complejo FRQ/FRH (FFC). ^{[ 15 ] [ 16 ]} FRQ también interactúa de forma estable con la caseína quinasa 1 (CK1) aunque la fuerza de la interacción cambia con la hora del día. Se conocen interacciones adicionales con otras quinasas, incluidas PRD-4 (CHK2) ^{[ 17 ]} y la caseína quinasa 2 (CKII).

Los programas de predicción estructural sugieren que solo unas pocas regiones de FRQ tienen probabilidades de plegarse en estructuras estables, y en consonancia con esto, una variedad de datos experimentales indican que FRQ es una proteína intrínsecamente desordenada . ^{[ 18 ]} En ausencia de su pareja FRH, FRQ es muy inestable. Se predice que la miríada de fosforilaciones específicas del momento del día que caracterizan a FRQ proporcionan estructura a esta proteína que de otro modo sería desordenada. No se conoce la estructura de dominios de FRQ debido a su estructura altamente desordenada.

Por lo general, las proteínas muestran un sesgo en el uso de codones, donde tienden a elegir codones sinónimos más disponibles en su conjunto de ARNt . Neurospora crassa presenta un sesgo en el uso de codones relativamente fuerte en comparación con S. cerevisiae , un organismo comúnmente utilizado para el análisis de optimización de codones. Sin embargo, debido a que FRQ es una proteína intrínsecamente desordenada, no presenta sesgo en el uso de codones. De hecho, cuando sus codones se optimizan, la proteína pierde su función y el reloj se altera. Este no es el caso de los genes del reloj de las cianobacterias , kaiB y kaiC , que dieron lugar a una función del reloj más robusta. ^{[ 19 ]}

Una descripción de la regulación de frq y FRQ requiere una descripción del ciclo del reloj. La base molecular del oscilador circadiano en Neurospora comienza con dos complejos proteicos. Uno es el FFC, el complejo del elemento negativo compuesto por dos copias de FRQ, FRH y Caseína quinasa 1, así como, probablemente, otras proteínas unidas con menor fuerza. ^{[ 16 ]} El otro complejo que actúa como el elemento positivo en el bucle de retroalimentación incluye WC-1 y WC-2; son factores de transcripción GATA que, juntos, forman el heterodímero WCC a través de sus dominios PAS . ^{[ 21 ]} Cuando WCC se libera del complejo del elemento negativo FFC durante la noche subjetiva, se une al promotor del gen clock-box within frequency ( frq ) y activa la transcripción de frq . ^{[ 22 ] [ 23 ]} Recientemente se ha demostrado que la histona H3 lisina 36 metiltransferasa , SET-2, es responsable de la metilación del gen frq para establecer un estado de cromatina que permitirá la transcripción de frq por el WCC. ^{[ 24 ]}

La proteína de frecuencia (FRQ) se acumula y se fosforila progresivamente por CKI, CKII y una quinasa dependiente de calcio/calmodulina (CAMK-1), y quinasas adicionales, alcanzando su pico alrededor de la mitad del día subjetivo. ^{[ 25 ] [ 26 ] [ 27 ]} Los inhibidores de quinasas reducen la degradación de FRQ al prevenir la fosforilación. ^{[ 28 ]} FRQ se fosforila en más de 100 sitios según análisis in vitro utilizando espectrometría de masas de péptidos lFRQ. Estos sitios aparecen dentro de la proteína de manera altamente reproducible, lo que indica que el momento de las fosforilaciones es importante. Además, la mutación de los sitios muestra que funcionan en dominios, con algunas fosforilaciones que sirven para alargar el período y otras para acortarlo. ^{[ 16 ]}

FRQ recluta quinasas como la caseína quinasa 1a (CK-1a) que fosforilan WCC, aunque la función de estas fosforilaciones no está clara ya que WCC hiperfosforilada permanece activa. Finalmente, la represión se alivia cuando FRQ se fosforila tanto que FFC deja de interactuar con WCC. Este proceso ocurre con una periodicidad de aproximadamente 22 horas en condiciones constantes. ^{[ 29 ]} Posteriormente, y con una cinética que no influye en el ciclo circadiano, esta FRQ hiperfosforilada se degrada a través de la vía de la ubiquitina/proteasoma. La FRQ altamente fosforilada experimenta un cambio conformacional que es detectado por la proteína FWD-1, que forma parte de la ligasa E3 de tipo SCF. ^{[ 30 ]}

FRQ forma un homodímero a través de su dominio de hélice enrollada ubicado cerca del extremo N-terminal . Esta dimerización es necesaria para que FRQ interactúe con el WCC y reprima su propia expresión. ^{[ 31 ]} La eliminación del WCC provoca la incapacidad de formar el homodímero, lo que hace que frq deje de estar regulado negativamente por la concentración de FRQ. ^{[ 31 ]} Esto conduce a arritmia. ^{[ 31 ]}

Se ha propuesto un bucle de retroalimentación positiva entre FRQ y WCC, pero aún se desconocen los detalles. Se cree que WCC se degrada cuando está transcripcionalmente activo, y que la prevención de esto causada por FFC permite una acumulación de WCC. ^{[ 32 ]} Se ha demostrado que este mecanismo propuesto es posiblemente más complejo, ya que FRQ puede regular WC-1 y WC-2 de forma independiente. ^{[ 33 ]} Recientemente, se identificó al factor de transcripción ADV-1 como un transductor necesario de las señales del reloj, incluida la ritmicidad circadiana en genes críticos para la fusión de células somáticas . ^{[ 34 ]}

El gen frq se induce fuertemente por la exposición breve a la luz. Dado que el núcleo del reloj se basa en la expresión rítmica de frq , la inducción aguda por luz proporciona una forma directa de reiniciar el reloj. ^{[ 35 ]} Los relojes de los mamíferos se reinician por la luz mediante un mecanismo casi idéntico, con la inducción de transcritos de mPer1 por breves destellos de luz fuera del día subjetivo. El mecanismo de mPer1 en el reloj de los mamíferos presenta mayores similitudes con el mecanismo de Neurospora que con el de su homólogo en Drosophila , per . ^{[ 36 ]}

La genética directa se ha utilizado para crear mutantes del reloj de Neurospora con periodos de conidiación variados . Aunque se han descrito nueve alelos como provenientes de la genética directa, el análisis de secuencia posterior a la clonación de frq mostró que frq [2], frq [4] y frq [6] compartían el mismo cambio de una sola base, y de igual manera frq [7] y frq [8] tenían el mismo cambio de una sola base, por lo que se han descartado los alelos redundantes. ^{[ 37 ]} Los periodos de varios mutantes frq que surgieron de los cribados directos son los siguientes cuando se miden a 25  °C, aunque debido a que frq [3] y frq [7] dan como resultado relojes con compensación de temperatura alterada, los periodos serán diferentes a otras temperaturas:

Se han descubierto varios osciladores identificablemente distintos fuera del sistema FRQ/WCC; sin embargo, ninguna de estas oscilaciones sin FRQ (FLO) satisface las características para ser clasificadas como osciladores circadianos . ^{[ 38 ]} Se ha demostrado, mediante informes de luciferasa , que el oscilador circadiano FRQ-WCC (FWO) continúa funcionando incluso cuando un FLO (el CDO u oscilador de deficiencia de colina que controla la conidiación en condiciones de limitación de colina) controla la conidiación. ^{[ 38 ]} En el mutante frq[9] Neurospora crassa , todavía se observó un ritmo de desarrollo de conidiosporas no compensado por la temperatura en oscuridad constante (DD). ^{[ 39 ]} El período para los mutantes nulos frq varió de 12 a 35 horas, pero pudo estabilizarse mediante la adición de farnesol o geraniol . Sin embargo, este mecanismo no se comprende bien. ^{[ 40 ]} Aunque este ritmo sin FRQ perdió ciertas características del reloj, como la compensación de temperatura, los pulsos de temperatura fueron suficientes para reiniciar el reloj. ^{[ 41 ]} Otro FLO es el NRO u Oscilador de Nitrato Reductasa que aparece en condiciones de inanición de nitrato y se cree que surge de bucles de retroalimentación dentro de la vía de asimilación de nitrato; tiene una duración de período de aproximadamente 24 horas, pero no está compensado por la temperatura. ^{[ 42 ]} En resumen, hay mucha evidencia que respalda los osciladores sin FRQ en Neurospora crassa. Una forma de racionalizar esto es asumir que muchos son "esclavos" del oscilador de frecuencia/collar blanco; no poseen todas las características de un reloj circadiano por sí mismos porque esto es proporcionado por el FWO. ^{[ 40 ]} Sin embargo, los ritmos en el gen 16 controlado por reloj (ccg-16) están acoplados al FWO pero funcionan de forma autónoma, lo que demuestra que Neurospora crassa contiene al menos 2 marcapasos potenciales, pero solo uno que puede reiniciarse por la luz y la temperatura mientras mantiene la compensación de temperatura. ^{[ 40 ] [ 43 ]} Nunca se ha demostrado que el oscilador sin FRQ afecte al verdadero reloj circadiano. ^{[ 43 ]} El mecanismo y la importancia de los osciladores sin FRQ (FLO) todavía están en investigación.

La proteína FRQ se conserva dentro de Sordariacea pero diverge fuera de este grupo. ^{[ 2 ] [ 44 ]} No obstante, se han encontrado relojes circadianos genuinos basados ​​en FRQ en organismos distintos de Neurospora , tanto dentro de Sordariacea , por ejemplo, en el destacado patógeno fúngico Botrytis, ^{[ 45 ]} como tan lejos como Pyronema ^{[ 46 ]} dentro de Pezizomycetes, un linaje de divergencia temprana de ascomicetos filamentosos. Frq incluso se encontró en el grupo de hongos no Dikarya. El hallazgo de frq y el mecanismo de reloj circadiano conservado dentro de los hongos micorrícicos arbusculares no Dikarya expandió la historia evolutiva de este gen en el reino Fungal. ^{[ 47 ]} frq parece divergir muy rápidamente durante su evolución. Parte de la razón por la que la secuencia de aminoácidos primaria de FRQ diverge tan rápidamente puede deberse a que es una proteína intrínsecamente desordenada y, como resultado, carece de las restricciones estructurales que limitan los cambios de secuencia. ^{[ 48 ] [ 18 ]} Dado que la optimización de codones del gen frq da como resultado una función de bucle de retroalimentación circadiano deteriorada , frq muestra un sesgo de uso de codones no óptimo en todo su marco de lectura abierto en contraste con la mayoría de los otros genes. ^{[ 49 ]} FRQ es una proteína intrínsecamente desordenada que no está bien conservada, incluso en hongos. ^{[ 50 ]} Sin embargo, a diferencia de FRQ, WC-1 está muy bien conservado. Es el miembro fundador de la familia de fotorreceptores de luz azul utilizados en todo el Reino de los hongos. Además, es similar en estructura y función a BMAL1 . La caseína quinasa 2 está conservada en los osciladores circadianos de plantas ( Arabidopsis ) y moscas ( Drosophila ). ^{[ 30 ]} Una forma similar de CKI es necesaria para la degradación de las proteínas period (PER) en Drosophila y mamíferos. ^{[ 30 ]} El gen slimb de Drosophila es ortólogo de FWD1 en Neurospora , ambos cruciales para la degradación de las proteínas del reloj. ^{[ 30 ]}En general, los TTFL presentes en hongos y animales comparten una arquitectura reguladora similar, con un bucle de retroalimentación negativa de un solo paso, activadores heterodiméricos PAS-PAS conservados y proteínas de elementos negativos que carecen en gran medida de estructura y están mucho menos conservadas. En todos los casos, un conjunto similar de quinasas modifica las proteínas del reloj circadiano.

• Retroalimentación negativa
• Cuello blanco-1