Proteína de fusión

La fusión de marcadores fluorescentes a proteínas en una célula huésped es una técnica muy utilizada en la investigación celular y biológica experimental para rastrear las interacciones proteicas en tiempo real. El primer marcador fluorescente, la proteína verde fluorescente (GFP), se aisló de Aequorea victoria y todavía se usa con frecuencia en la investigación moderna. Entre las derivaciones más recientes se encuentran las proteínas fluorescentes fotoconvertibles (PCFP), que se aislaron por primera vez de Anthozoa . La PCFP más utilizada es el marcador fluorescente Kaede , pero el desarrollo de Kikume verde-rojo (KikGR) en 2005 ofrece una señal más brillante y una fotoconversión más eficiente. La ventaja de usar marcadores fluorescentes PCFP es la capacidad de rastrear la interacción de vías bioquímicas superpuestas en tiempo real. El marcador cambia de color de verde a rojo cuando la proteína alcanza un punto de interés en la vía, y la proteína con el color alternativo se puede monitorear durante toda la duración de la vía. Esta técnica es especialmente útil al estudiar las vías de reciclaje de receptores acoplados a proteínas G (GPCR). El destino de los receptores de proteína G reciclados puede ser enviarlos a la membrana plasmática para su reciclaje, marcados con una etiqueta fluorescente verde, o enviarlos a un lisosoma para su degradación, marcados con una etiqueta fluorescente roja. ^{[ 2 ]}

El objetivo de crear proteínas de fusión en el desarrollo de fármacos es conferir propiedades de cada una de las proteínas "originales" a la proteína quimérica resultante. Actualmente, existen varios fármacos basados ​​en proteínas quiméricas disponibles para uso médico.

Muchos fármacos de proteínas quiméricas son anticuerpos monoclonales cuya especificidad para una molécula diana se desarrolló utilizando ratones y, por lo tanto, inicialmente se denominaban anticuerpos de ratón. Al ser proteínas no humanas, los anticuerpos de ratón tienden a provocar una reacción inmunitaria si se administran a humanos. El proceso de quimerización implica la ingeniería de segmentos de la molécula del anticuerpo que lo distinguen de un anticuerpo humano. Por ejemplo, se pueden introducir dominios constantes humanos, eliminando así la mayoría de las porciones potencialmente inmunogénicas del fármaco sin alterar su especificidad para la diana terapéutica prevista. La nomenclatura de anticuerpos indica este tipo de modificación insertando -xi- en el nombre no patentado (p. ej., abci -xi -mab ). Si también se reemplazan partes de los dominios variables por porciones humanas, se obtienen anticuerpos humanizados . Aunque no se distinguen conceptualmente de las quimeras, este tipo se indica utilizando -zu-, como en dacli- zu -mab . Consulte la lista de anticuerpos monoclonales para obtener más ejemplos.

Además de los anticuerpos quiméricos y humanizados, existen otros fines farmacéuticos para la creación de construcciones quiméricas. El etanercept , por ejemplo, es un bloqueador del TNFα creado mediante la combinación de un receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR) con el segmento Fc de la inmunoglobulina G1 . Se cree que el TNFR proporciona especificidad para la diana del fármaco y que el segmento Fc del anticuerpo aumenta la estabilidad y la capacidad de administración del fármaco. ^{[ 3 ]} Otras proteínas quiméricas utilizadas para aplicaciones terapéuticas incluyen:

• Aflibercept : Una proteína recombinante humana que ayuda en el tratamiento del cáncer colorrectal metastásico resistente al oxaliplatino, la degeneración macular neovascular y el edema macular . ^{[ 3 ]}
• Rilonacept : Reduce la inflamación al prevenir la activación de los receptores de IL-1 para tratar los síndromes periódicos asociados a la criopirina (CAPS). ^{[ 3 ]}
• Alefacept : Regula las respuestas de las células T al dirigirse selectivamente a las células T de memoria efectoras para tratar la psoriasis vulgar . ^{[ 3 ]}
• Romiplostim : Un peptibody que trata la trombocitopenia inmune . ^{[ 3 ]}
• Abatacept / Belatacept : Interfiere con la coestimulación de las células T para tratar trastornos autoinmunes como la artritis reumatoide , la artritis psoriásica y la psoriasis . ^{[ 3 ]}
• Denileukina-diftitox : Trata el linfoma cutáneo . ^{[ 3 ]}

Las nuevas tecnologías recombinantes han permitido mejorar el diseño de proteínas de fusión para su uso en campos tan diversos como la biodetección, las industrias papelera y alimentaria, y los biofármacos. Las mejoras recientes han implicado la fusión de péptidos individuales o fragmentos de proteínas a regiones de proteínas existentes, como los extremos N y C , y se sabe que aumentan las siguientes propiedades: ^{[ 5 ]}

• Eficiencia catalítica : La fusión de ciertos péptidos permite una mayor eficiencia catalítica al alterar la estructura terciaria y cuaternaria de la proteína diana. ^{[ 5 ]}
• Solubilidad : Un desafío común en el diseño de proteínas de fusión es la insolubilidad de las proteínas de fusión recién sintetizadas en el huésped recombinante, lo que provoca una agregación excesiva de la proteína diana en la célula. Se pueden añadir chaperonas moleculares que faciliten el plegamiento de la proteína, lo que permite una mejor separación de las interacciones hidrofóbicas e hidrofílicas en el soluto y, por consiguiente, una mayor solubilidad de la proteína. ^{[ 5 ]}
• Termoestabilidad : Se suelen añadir péptidos o fragmentos de proteínas individuales para reducir la flexibilidad del extremo N o C de la proteína diana, lo que refuerza la termoestabilidad y estabiliza el rango de pH . ^{[ 5 ]}
• Actividad enzimática: La fusión que implica la introducción de enlaces de hidrógeno puede utilizarse para ampliar la actividad enzimática general. ^{[ 5 ]}
• Niveles de expresión: La adición de numerosos fragmentos de fusión, como la proteína de unión a maltosa (MBP) o la molécula pequeña similar a la ubiquitina ( SUMO ), sirve para mejorar la expresión enzimática y la secreción de la proteína diana. ^{[ 5 ]}
• Inmovilización: La PHA sintasa, una enzima que permite la inmovilización de proteínas de interés, es una etiqueta de fusión importante en la investigación industrial. ^{[ 5 ]}
• Calidad del cristal: La calidad del cristal se puede mejorar añadiendo enlaces covalentes entre proteínas, lo que facilita las técnicas de determinación de la estructura. ^{[ 5 ]}

Las proteínas de interés se conectan simplemente extremo con extremo mediante la fusión de los extremos N o C entre ellas. Esto proporciona una estructura de puente flexible que permite suficiente espacio entre los socios de fusión para asegurar un plegamiento adecuado . Sin embargo, los extremos N o C del péptido suelen ser componentes cruciales para obtener el patrón de plegamiento deseado para la proteína recombinante, lo que hace que la simple unión extremo con extremo de los dominios sea ineficaz en este caso. Por esta razón, a menudo se necesita un conector proteico para mantener la funcionalidad de los dominios proteicos de interés. ^{[ 6 ]}

Esta técnica implica la fusión de dominios proteicos consecutivos mediante la codificación de las estructuras deseadas en una única cadena polipeptídica, aunque en ocasiones puede requerir la inserción de un dominio dentro de otro. Generalmente, se considera que esta técnica es más difícil de realizar que la fusión en tándem, debido a la dificultad de encontrar un sitio de ligación adecuado en el gen de interés. ^{[ 6 ]}

Esta técnica fusiona dominios proteicos después de la traducción ribosomal de las proteínas de interés, a diferencia de la fusión genética previa a la traducción utilizada en otras tecnologías recombinantes. ^{[ 6 ]}

Los conectores proteicos facilitan el diseño de proteínas de fusión al proporcionar el espaciado adecuado entre dominios, lo que favorece el correcto plegamiento de la proteína cuando las interacciones de los extremos N o C son cruciales para dicho plegamiento. Generalmente, los conectores proteicos permiten interacciones importantes entre dominios, refuerzan la estabilidad y reducen el impedimento estérico, por lo que se prefieren para su uso en el diseño de proteínas de fusión, incluso cuando los extremos N y C pueden fusionarse. Existen tres tipos principales de conectores: flexibles, rígidos y escindibles in vivo. ^{[ 6 ] [ 7 ]}

• Los enlazadores flexibles pueden consistir en muchos residuos pequeños de glicina , lo que les da la capacidad de curvarse en una forma dinámica y adaptable. ^{[ 7 ]}
• Los enlazadores rígidos pueden estar formados por grandes residuos de prolina cíclicos , lo que puede ser útil cuando se debe mantener un espaciamiento muy específico entre dominios. ^{[ 7 ]}
• Los enlazadores escindibles in vivo son únicos porque están diseñados para permitir la liberación de uno o más dominios fusionados bajo ciertas condiciones de reacción, como un gradiente de pH específico o al entrar en contacto con otra biomolécula en la célula. ^{[ 7 ]}