Ensayo GLAD-PCR

El ensayo de PCR dependiente de adaptador de hidrólisis de GLAD ( ensayo GLAD-PCR ^{[ 1 ]} ) es un método novedoso para determinar los sitios R(5mC)GY producidos durante la metilación de novo del ADN con las ADN metiltransferasas DNMT3A y DNMT3B . El ensayo GLAD-PCR no requiere tratamiento con bisulfito del ADN.

El método se diseñó específicamente para determinar la metilación del sitio RCGY de interés en genomas humanos y de mamíferos, en mayor medida que los sitios no metilados correspondientes. Esta es una situación típica en preparaciones de ADN obtenidas de muestras clínicas de sangre y tejidos.

El ensayo GLAD-PCR se basa en un nuevo tipo de enzimas: las endonucleasas de ADN dirigidas a la metilación específica del sitio (endonucleasas de ADN MD). Estas enzimas son muy similares a las enzimas de restricción en sus propiedades bioquímicas y cortan el ADN por completo, pero actúan de forma opuesta: solo cortan el ADN metilado y no cortan en absoluto el ADN no metilado.

Las ADN-metiltransferasas de mamíferos DNMT1, DNMT3a y DNMT3b catalizan una reacción de metilación del ADN.

• La proteína DNMT1 mantiene el patrón de metilación del ADN in vivo, modificando una nueva hebra después de la replicación.
• DNMT3a y DNMT3b son responsables de la metilación de novo del ADN , incluida la hipermetilación anormal en las células cancerosas.

Es bien sabido que la hipermetilación de las islas CpG en las regiones reguladoras del promotor y/o del primer exón de diversos genes suele ocurrir en las primeras etapas de la carcinogénesis esporádica . Esto provoca una disminución de la expresión génica en las células tumorales, mientras que en un tejido sano los genes correspondientes permanecen activos. ^{[ 2 ]} Por lo tanto, la detección de estos biomarcadores epigenéticos es una de las herramientas diagnósticas y pronósticas más prometedoras. ^{[ 3 ]}

El estudio de la especificidad de sustrato de DNMT3a y DNMT3b ha demostrado que ambas enzimas reconocen predominantemente el sitio RCGY y modifican el dinucleótido CG interno para formar la secuencia 5'-R(5mC)GY-3'/3'-YG(5mC) R-5'. ^{[ 4 ]} Una de las nuevas enzimas, GlaI, reconoce y escinde el sitio R(5mC)GY. ^{[ 5 ]} Debido a esta especificidad de sustrato única, GlaI es una herramienta conveniente para la identificación de sitios metilados de novo en el ADN humano y de mamíferos.

El ensayo GLAD-PCR incluye 3 sencillos pasos:

1. Hidrólisis del ADN estudiado mediante GlaI. En esta etapa, solo se hidrolizan los sitios R(5mC)GY. Los sitios RCGY no metilados permanecen intactos.
2. La ligación del adaptador universal. Como adaptador se utiliza un dúplex de oligonucleótidos 5'-CCTGCTCTTTCATCG-3'/3'-pGGACGAGAAAGTAGCp-5', donde “p” significa fosfato.
3. PCR en tiempo real posterior con sonda Taqman. El cebador genómico y la sonda TaqMan están diseñados para la región de ADN de interés; otro cebador híbrido consta de dos partes: una parte es complementaria al adaptador universal y la otra al ADN en el punto de hidrólisis de GlaI.

   

El ensayo se realiza en un solo tubo, dura aproximadamente de 2 a 3 horas y determina incluso varias copias de ADN con el sitio de interés R(5mC)GY.