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expresión génica

La expresión génica es el proceso mediante el cual la información contenida en un gen se utiliza para producir un producto génico funcional, como una proteína o una molécula de ...

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La expresión génica es el proceso mediante el cual la información contenida en un gen se utiliza para producir un producto génico funcional, como una proteína o una molécula de ARN funcional . Este proceso implica múltiples pasos, incluyendo la transcripción de la secuencia del gen a ARN. En el caso de los genes que codifican proteínas, este ARN se traduce posteriormente en una cadena de aminoácidos que se pliega para formar una proteína, mientras que en el caso de los genes no codificantes, el ARN resultante cumple una función en la célula. La expresión génica permite a las células utilizar la información genética para llevar a cabo una amplia gama de funciones biológicas. Si bien los niveles de expresión pueden regularse en respuesta a las necesidades celulares y los cambios ambientales, algunos genes se expresan continuamente con poca variación. [ 1 ]

Mecanismo

Transcripción

La ARN polimerasa se desplaza a lo largo de un segmento de ADN, dejando tras de sí una hebra de ARN recién sintetizada.
El proceso de transcripción lo lleva a cabo la ARN polimerasa (RNAP), que utiliza el ADN (negro) como plantilla y produce ARN (azul).

La producción de una copia de ARN a partir de una cadena de ADN se denomina transcripción y la llevan a cabo las ARN polimerasas , que añaden un ribonucleótido a la vez a una cadena de ARN en crecimiento según la ley de complementariedad de las bases nucleotídicas. Este ARN es complementario a la cadena de ADN molde 3′ → 5′, [ 2 ] con la excepción de que las timinas (T) se sustituyen por uracilos (U) en el ARN y pueden producirse errores.

En las bacterias , la transcripción es llevada a cabo por un único tipo de ARN polimerasa, que necesita unirse a una secuencia de ADN llamada caja de Pribnow con la ayuda de la proteína factor sigma (factor σ) para iniciar la transcripción. En los eucariotas, la transcripción se realiza en el núcleo por tres tipos de ARN polimerasas, cada una de las cuales necesita una secuencia de ADN especial llamada promotor y un conjunto de proteínas de unión al ADN —factores de transcripción— para iniciar el proceso (véase la regulación de la transcripción más adelante). La ARN polimerasa I es responsable de la transcripción de los genes del ARN ribosómico (ARNr). La ARN polimerasa II (Pol II) transcribe todos los genes que codifican proteínas, pero también algunos ARN no codificantes ( p. ej. , ARNsn, ARNsno o ARN largos no codificantes ). La ARN polimerasa III transcribe el ARNr 5S , los genes del ARN de transferencia (ARNt) y algunos ARN pequeños no codificantes ( p. ej ., 7SK ). La transcripción finaliza cuando la polimerasa encuentra una secuencia llamada terminador .

Procesamiento del ARNm

Mientras que la transcripción de genes procariotas que codifican proteínas crea ARN mensajero (ARNm) listo para su traducción a proteína, la transcripción de genes eucariotas deja un transcrito primario de ARN (pre-ARN), que primero debe sufrir una serie de modificaciones para convertirse en un ARN maduro. Los tipos y pasos involucrados en los procesos de maduración varían entre los pre-ARN codificantes y no codificantes; es decir, aunque las moléculas de pre-ARN tanto para el ARNm como para el ARNt sufren empalme, los pasos y la maquinaria involucrados son diferentes. [ 3 ] El procesamiento del ARN no codificante se describe a continuación (maduración del ARN no codificante).

El procesamiento del pre-ARNm incluye la adición de una caperuza 5′ , que es un conjunto de reacciones enzimáticas que agregan 7-metilguanosina (m7G ) al extremo 5′ del pre-ARNm y, por lo tanto, protegen el ARN de la degradación por exonucleasas . [ 4 ] La caperuza m7G se une luego al heterodímero del complejo de unión a la caperuza (CBP20/CBP80), que ayuda a la exportación del ARNm al citoplasma y también protege el ARN de la eliminación de la caperuza . [ 5 ]

Otra modificación es la escisión 3′ y la poliadenilación . [ 6 ] Ocurren si la secuencia señal de poliadenilación (5′- AAUAAA-3′) está presente en el pre-ARNm, que generalmente se encuentra entre la secuencia codificante de proteínas y el terminador. [ 7 ] El pre-ARNm se escinde primero y luego se agregan una serie de ~200 adeninas (A) para formar la cola de poli(A), que protege al ARN de la degradación. [ 8 ] La cola de poli(A) es unida por múltiples proteínas de unión a poli(A) (PABP) necesarias para la exportación del ARNm y la reiniciación de la traducción. [ 9 ] En el proceso inverso de desadenilación, las colas de poli(A) son acortadas por la exonucleasa CCR4-Not 3′-5′, lo que a menudo conduce a la degradación completa del transcrito. [ 10 ]

El pre-ARNm se procesa mediante empalme para formar el ARNm maduro.
Ilustración de exones e intrones en el pre-ARNm y la formación del ARNm maduro mediante empalme. Las UTR (en verde) son las partes no codificantes de los exones en los extremos del ARNm.

Una modificación muy importante del pre-ARNm eucariota es el empalme de ARN . La mayoría de los pre-ARNm eucariotas constan de segmentos alternados llamados exones e intrones . [ 11 ] Durante el proceso de empalme, un complejo catalítico de ARN-proteína conocido como espliceosoma cataliza dos reacciones de transesterificación , que eliminan un intrón y lo liberan en forma de estructura de lazo, y luego unen los exones vecinos. [ 12 ] En ciertos casos, algunos intrones o exones pueden eliminarse o conservarse en el ARNm maduro. [ 13 ] Este llamado empalme alternativo crea una serie de diferentes transcripciones que se originan a partir de un solo gen. Debido a que estas transcripciones pueden traducirse potencialmente en diferentes proteínas, el empalme aumenta la complejidad de la expresión génica eucariota y el tamaño del proteoma de una especie . [ 14 ]

El procesamiento extenso del ARN podría ser una ventaja evolutiva posibilitada por el núcleo de los eucariotas. En los procariotas, la transcripción y la traducción ocurren simultáneamente, mientras que en los eucariotas, la membrana nuclear separa ambos procesos, lo que permite que se produzca el procesamiento del ARN. [ 15 ]

Maduración del ARN no codificante

En la mayoría de los organismos, los genes no codificantes (ARNnc) se transcriben como precursores que luego se procesan. En el caso de los ARN ribosómicos (ARNr), a menudo se transcriben como un pre-ARNr que contiene uno o más ARNr. El pre-ARNr se escinde y modifica ( 2′- O- metilación y formación de pseudouridina ) en sitios específicos por aproximadamente 150 especies diferentes de ARN restringidos al nucléolo pequeño, llamados snoARN. Los snoARN se asocian con proteínas, formando snoRNP. Mientras que la parte del snoARN se aparea con el ARN diana y, por lo tanto, posiciona la modificación en un sitio preciso, la parte proteica realiza la reacción catalítica. En eucariotas, en particular una snoRNP llamada ARNasa, MRP, escinde el pre-ARNr 45S en los ARNr 28S , 5.8S y 18S . El ARNr y los factores de procesamiento del ARN forman grandes agregados llamados nucléolo . [ 16 ]

En el caso del ARN de transferencia (ARNt), por ejemplo, la secuencia 5′ es eliminada por la RNasa P , [ 17 ] mientras que el extremo 3′ es eliminado por la enzima tRNasa Z [ 18 ] y la cola 3′ CCA no moldeada es agregada por una nucleotidil transferasa . [ 19 ] En el caso del microARN (miARN) , los miARN se transcriben primero como transcritos primarios o pri-miARN con una caperuza y una cola de poli-A y se procesan en estructuras cortas de tallo-bucle de 70 nucleótidos conocidas como pre-miARN en el núcleo celular por las enzimas Drosha y Pasha . Después de ser exportado, luego se procesa a miARN maduros en el citoplasma por interacción con la endonucleasa Dicer , que también inicia la formación del complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) , compuesto por la proteína Argonaute .

Incluso los snRNA y los snoRNA sufren una serie de modificaciones antes de formar parte del complejo RNP funcional. [ 20 ] Esto se lleva a cabo en el nucleoplasma o en compartimentos especializados llamados cuerpos de Cajal . [ 21 ] Sus bases son metiladas o pseudouridiniladas por un grupo de pequeños ARN específicos de los cuerpos de Cajal (scaRNA) , que son estructuralmente similares a los snoRNA. [ 22 ]

Traducción

Para algunos ARN no codificantes, el ARN maduro es el producto génico final. [ 23 ] En el caso del ARN mensajero (ARNm), el ARN es un portador de información que codifica para la síntesis de una o más proteínas. El ARNm que lleva una sola secuencia de proteína (común en eucariotas) es monocistrónico, mientras que el ARNm que lleva múltiples secuencias de proteínas (común en procariotas) se conoce como policistrónico .

El ribosoma traduce el ARN mensajero en una cadena de aminoácidos (proteína).
Durante la traducción, el ARNt cargado con el aminoácido entra en el ribosoma y se alinea con el triplete de ARNm correcto. A continuación, el ribosoma añade el aminoácido a la cadena proteica en crecimiento.

Cada ARNm consta de tres partes: una región no traducida 5' (5'UTR), una región codificante de proteínas o marco de lectura abierto (ORF) y una región no traducida 3' (3'UTR). La región codificante contiene la información para la síntesis de proteínas codificada por el código genético para formar tripletes. Cada triplete de nucleótidos de la región codificante se denomina codón y corresponde a un sitio de unión complementario a un triplete de anticodón en el ARN de transferencia. Los ARN de transferencia con la misma secuencia de anticodón siempre contienen un tipo idéntico de aminoácido . Los aminoácidos se unen mediante el ribosoma según el orden de los tripletes en la región codificante. El ribosoma ayuda al ARN de transferencia a unirse al ARN mensajero y toma el aminoácido de cada ARN de transferencia para sintetizar una proteína sin estructura definida. [ 24 ] [ 25 ] Cada molécula de ARNm se traduce en muchas moléculas de proteína, en promedio ~2800 en mamíferos. [ 26 ] [ 27 ]

En procariotas, la traducción generalmente ocurre en el punto de transcripción (cotranscripcionalmente), a menudo utilizando un ARN mensajero que aún se está creando. En eucariotas, la traducción puede ocurrir en diversas regiones de la célula, dependiendo de dónde se supone que se encuentra la proteína que se está escribiendo. Las principales ubicaciones son el citoplasma para las proteínas citoplasmáticas solubles y la membrana del retículo endoplasmático para las proteínas destinadas a la exportación celular o a la inserción en una membrana celular . Las proteínas que se supone que se producen en el retículo endoplasmático son reconocidas a mitad del proceso de traducción. Esto está regulado por la partícula de reconocimiento de señal , una proteína que se une al ribosoma y lo dirige al retículo endoplasmático cuando encuentra un péptido señal en la cadena de aminoácidos en crecimiento (naciente). [ 28 ]

Regulación

Un gato con manchas de pelaje naranja y negro.
Los colores irregulares de un gato carey son el resultado de diferentes niveles de expresión de los genes de pigmentación en diferentes áreas de la piel .

La regulación de la expresión génica consiste en controlar la cantidad y el momento de aparición del producto funcional de un gen. Este control es vital para que la célula produzca los productos génicos que necesita cuando los necesita; a su vez, esto le confiere la flexibilidad necesaria para adaptarse a un entorno variable, señales externas, daños celulares y otros estímulos. En términos más generales, la regulación génica otorga a la célula control sobre toda su estructura y función, y constituye la base de la diferenciación celular , la morfogénesis y la versatilidad y adaptabilidad de cualquier organismo.

Se utilizan numerosos términos para describir los tipos de genes según cómo se regulan; entre ellos se incluyen:

  • Un gen constitutivo es un gen que se transcribe continuamente, a diferencia de un gen facultativo, que solo se transcribe cuando es necesario.
  • Un gen constitutivo es aquel necesario para mantener las funciones celulares básicas y, por lo tanto, se expresa en todos los tipos celulares de un organismo. Algunos ejemplos son la actina , la GAPDH y la ubiquitina . Algunos genes constitutivos se transcriben a una tasa relativamente constante y pueden utilizarse como referencia en experimentos para medir la expresión de otros genes.
  • Un gen facultativo es un gen que solo se transcribe cuando es necesario, a diferencia de un gen constitutivo.
  • Un gen inducible es un gen cuya expresión responde a cambios ambientales o depende de la fase del ciclo celular.

Cualquier paso de la expresión génica puede modularse, desde la transcripción de ADN-ARN hasta la modificación postraduccional de una proteína. La estabilidad del producto génico final, ya sea ARN o proteína, también contribuye al nivel de expresión del gen: un producto inestable resulta en un bajo nivel de expresión. En general, la expresión génica se regula mediante cambios [ 29 ] en el número y tipo de interacciones entre moléculas [ 30 ] que, en conjunto, influyen en la transcripción del ADN [ 31 ] y la traducción del ARN [ 32 ] .

Algunos ejemplos sencillos de situaciones en las que la expresión génica es importante son:

Transcripcional

Cuando la lactosa está presente en un procariota, actúa como inductor e inactiva el represor, de modo que los genes para el metabolismo de la lactosa pueden transcribirse.

La regulación de la transcripción se puede dividir en tres vías principales de influencia: genética (interacción directa de un factor de control con el gen), modulación (interacción de un factor de control con la maquinaria de transcripción) y epigenética (cambios no secuenciales en la estructura del ADN que influyen en la transcripción). [ 33 ] [ 34 ]

Diagrama de cinta del dímero represor lambda unido al ADN.
El factor de transcripción represor lambda (verde) se une como dímero al surco mayor del ADN diana (rojo y azul) e inhibe el inicio de la transcripción. Fuente: PDB : 1LMB .

La interacción directa con el ADN es el método más simple y directo mediante el cual una proteína modifica los niveles de transcripción. [ 35 ] Los genes suelen tener varios sitios de unión de proteínas alrededor de la región codificante con la función específica de regular la transcripción. [ 36 ] Existen muchas clases de sitios de unión de ADN reguladores conocidos como potenciadores , aisladores y silenciadores . [ 37 ] Los mecanismos para regular la transcripción son variados, desde el bloqueo de sitios de unión clave en el ADN para la ARN polimerasa hasta la actuación como activador y la promoción de la transcripción mediante la asistencia a la unión de la ARN polimerasa. [ 38 ]

La actividad de los factores de transcripción se modula además mediante señales intracelulares que provocan modificaciones postraduccionales de las proteínas, como la fosforilación , la acetilación o la glicosilación . [ 39 ] Estos cambios influyen en la capacidad de un factor de transcripción para unirse, directa o indirectamente, al ADN promotor, reclutar la ARN polimerasa o favorecer la elongación de una molécula de ARN recién sintetizada. [ 40 ]

La membrana nuclear en eucariotas permite una mayor regulación de los factores de transcripción mediante la duración de su presencia en el núcleo, la cual está regulada por cambios reversibles en su estructura y por la unión de otras proteínas. [ 41 ] Los estímulos ambientales o las señales endocrinas [ 42 ] pueden causar la modificación de las proteínas reguladoras [ 43 ] desencadenando cascadas de señales intracelulares, [ 44 ] que resultan en la regulación de la expresión génica.

Se ha hecho evidente que existe una influencia significativa de efectos no específicos de la secuencia de ADN en la transcripción. [ 45 ] Estos efectos se denominan epigenéticos e involucran la estructura de orden superior del ADN, proteínas de unión al ADN no específicas de la secuencia y la modificación química del ADN. [ 46 ] En general, los efectos epigenéticos alteran la accesibilidad del ADN a las proteínas y, por lo tanto, modulan la transcripción. [ 47 ]

Representación esquemática de la estructura del nucleosoma.
En los eucariotas, el ADN se organiza en forma de nucleosomas . Nótese cómo el ADN (azul y verde) se enrolla firmemente alrededor del núcleo proteico formado por octámeros de histonas (estructuras helicoidales), lo que restringe el acceso al ADN. Fuente: PDB : 1KX5 .

En los eucariotas, la estructura de la cromatina , controlada por el código de histonas , regula el acceso al ADN con impactos significativos en la expresión de genes en áreas de eucromatina y heterocromatina . [ 48 ]

Potenciadores, factores de transcripción, complejo mediador y bucles de ADN

Regulación de la transcripción en mamíferos . Una región reguladora potenciadora activa interactúa con la región promotora de su gen diana mediante la formación de un bucle cromosómico. Esto inicia la síntesis de ARN mensajero (ARNm) por la ARN polimerasa II (ARNp II) unida al promotor en el sitio de inicio de la transcripción del gen. El bucle se estabiliza mediante una proteína estructural anclada a la potenciadora y otra anclada al promotor, las cuales se unen para formar un dímero (zigzags rojos). Factores de transcripción reguladores específicos se unen a motivos de secuencia de ADN en la potenciadora. Factores de transcripción generales se unen al promotor. Cuando un factor de transcripción se activa mediante una señal (aquí indicada como fosforilación, representada por una pequeña estrella roja en un factor de transcripción en la potenciadora), la potenciadora se activa y puede activar su promotor diana. La potenciadora activa se transcribe en cada hebra de ADN en direcciones opuestas por las ARNp II unidas. Las proteínas mediadoras (un complejo formado por unas 26 proteínas en una estructura interactiva) transmiten señales reguladoras desde los factores de transcripción unidos al ADN potenciador hasta el promotor.

La expresión génica en mamíferos está regulada por numerosos elementos cis-reguladores , incluyendo promotores centrales y elementos proximales al promotor que se localizan cerca de los sitios de inicio de la transcripción de los genes, aguas arriba en el ADN (hacia la región 5' de la cadena codificante ). Otros módulos cis-reguladores importantes se localizan en regiones del ADN alejadas de los sitios de inicio de la transcripción. Estos incluyen potenciadores , silenciadores , aisladores y elementos de anclaje. [ 49 ] Los potenciadores y sus factores de transcripción asociados desempeñan un papel fundamental en la regulación de la expresión génica. [ 50 ]

Los potenciadores son regiones del genoma que regulan los genes. Controlan programas de expresión génica específicos de cada tipo celular, generalmente mediante bucles que se extienden a lo largo de grandes distancias para acercarse físicamente a los promotores de sus genes diana. [ 51 ] Múltiples potenciadores, cada uno a menudo a decenas o cientos de miles de nucleótidos de distancia de sus genes diana, se unen a los promotores de estos genes y se coordinan entre sí para controlar la expresión génica. [ 51 ]

La ilustración muestra un potenciador formando un bucle para acercarse al promotor de un gen diana. El bucle se estabiliza mediante un dímero de una proteína conectora (por ejemplo, un dímero de CTCF o YY1 ). Un miembro del dímero se ancla a su motivo de unión en el potenciador y el otro se ancla a su motivo de unión en el promotor (representado por los zigzags rojos en la ilustración). [ 52 ] Varios factores de transcripción específicos de la función celular (entre los aproximadamente 1600 factores de transcripción en una célula humana) [ 53 ] generalmente se unen a motivos específicos en un potenciador. [ 54 ] Una pequeña combinación de estos factores de transcripción unidos al potenciador, cuando se acercan a un promotor mediante un bucle de ADN, regulan el nivel de transcripción del gen diana. El mediador (un complejo que generalmente consta de aproximadamente 26 proteínas en una estructura interactiva) comunica las señales reguladoras de los factores de transcripción unidos al ADN del potenciador directamente a la enzima ARN polimerasa II (pol II) unida al promotor. [ 55 ]

Los potenciadores, cuando están activos, generalmente se transcriben a partir de ambas hebras de ADN con ARN polimerasas que actúan en dos direcciones diferentes, produciendo dos eRNA como se ilustra en la figura. [ 56 ] Un potenciador inactivo puede estar unido a un factor de transcripción inactivo. La fosforilación del factor de transcripción puede activarlo y ese factor de transcripción activado puede luego activar el potenciador al que está unido (ver la pequeña estrella roja que representa la fosforilación del factor de transcripción unido al potenciador en la ilustración). [ 57 ] Un potenciador activado comienza la transcripción de su ARN antes de activar la transcripción del ARN mensajero de su gen diana. [ 58 ]

Metilación y desmetilación del ADN

La metilación del ADN es la adición de un grupo metilo al ADN en la citosina . La imagen muestra una base de citosina de un solo anillo con un grupo metilo unido al carbono 5. En los mamíferos, la metilación del ADN ocurre casi exclusivamente en una citosina seguida de una guanina .

La metilación del ADN es un mecanismo generalizado de influencia epigenética sobre la expresión génica, presente en bacterias y eucariotas , y que desempeña un papel en el silenciamiento transcripcional hereditario y la regulación de la transcripción. La metilación suele producirse en una citosina (véase la figura). La metilación de la citosina se produce principalmente en secuencias de dinucleótidos donde una citosina está seguida de una guanina, un sitio CpG . El número de sitios CpG en el genoma humano es de aproximadamente 28 millones. [ 59 ] Dependiendo del tipo de célula, alrededor del 70 % de los sitios CpG tienen una citosina metilada. [ 60 ]

La metilación de la citosina en el ADN desempeña un papel fundamental en la regulación de la expresión génica. La metilación de los CpG en la región promotora de un gen generalmente reprime la transcripción génica [ 61 ], mientras que la metilación de los CpG en el cuerpo del gen aumenta su expresión [ 62 ] . Las enzimas TET desempeñan un papel central en la desmetilación de las citosinas metiladas. La desmetilación de los CpG en el promotor de un gen mediante la actividad de las enzimas TET aumenta la transcripción del gen [ 63 ] .

Regulación postranscripcional

En eucariotas, donde la exportación de ARN es necesaria antes de que sea posible la traducción, se cree que la exportación nuclear proporciona un control adicional sobre la expresión génica. Todo el transporte dentro y fuera del núcleo se realiza a través del poro nuclear y está controlado por una amplia gama de proteínas importinas y exportinas . [ 64 ]

La expresión de un gen que codifica una proteína solo es posible si el ARN mensajero que lleva el código sobrevive el tiempo suficiente para ser traducido. [ 65 ] En una célula típica, una molécula de ARN solo es estable si está protegida específicamente de la degradación. [ 66 ] La degradación del ARN tiene una importancia particular en la regulación de la expresión en células eucariotas donde el ARNm tiene que recorrer distancias significativas antes de ser traducido. [ 67 ] En eucariotas, el ARN se estabiliza mediante ciertas modificaciones postranscripcionales, en particular la caperuza 5′ y la cola poliadenilada . [ 9 ]

La degradación intencional del ARNm se utiliza no solo como mecanismo de defensa contra el ARN extraño (normalmente de virus), sino también como vía de desestabilización del ARNm . [ 68 ] Si una molécula de ARNm tiene una secuencia complementaria a un ARN de interferencia pequeño , entonces se la ataca para su destrucción a través de la vía de interferencia de ARN . [ 69 ]

Tres regiones no traducidas principales y microARN

Las regiones 3' no traducidas (3'UTR) de los ARN mensajeros (ARNm) suelen contener secuencias reguladoras que influyen en la expresión génica a nivel postranscripcional. Estas 3'UTR suelen contener sitios de unión tanto para microARN (miARN) como para proteínas reguladoras. [ 70 ] Al unirse a sitios específicos dentro de la 3'UTR, los miARN pueden disminuir la expresión génica de diversos ARNm, ya sea inhibiendo la traducción o provocando directamente la degradación del transcrito. [ 71 ] La 3'UTR también puede tener regiones silenciadoras que se unen a proteínas represoras que inhiben la expresión de un ARNm. [ 72 ]

La región 3′-UTR suele contener elementos de respuesta a microARN (MRE) . Los MRE son secuencias a las que se unen los microARN. Estos son motivos frecuentes dentro de las regiones 3′-UTR. Entre todos los motivos reguladores dentro de las regiones 3′-UTR (incluidas, por ejemplo, las regiones silenciadoras), los MRE constituyen aproximadamente la mitad de los motivos. [ 73 ]

En 2014, el sitio web miRBase , [ 74 ] un archivo de secuencias y anotaciones de miRNA , enumeraba 28 645 entradas en 233 especies biológicas. De estas, 1881 miRNAs estaban en loci de miRNA humanos anotados. Se predijo que los miRNAs tenían un promedio de alrededor de cuatrocientos ARNm diana (que afectan la expresión de varios cientos de genes). [ 75 ] Friedman et al. [ 75 ] estiman que >45 000 sitios diana de miRNA dentro de las 3′UTR del ARNm humano están conservados por encima de los niveles basales, y >60 % de los genes humanos codificadores de proteínas han estado bajo presión selectiva para mantener el emparejamiento con miRNAs.

Los experimentos directos muestran que un solo miRNA puede reducir la estabilidad de cientos de ARNm únicos. [ 76 ] Otros experimentos muestran que un solo miRNA puede reprimir la producción de cientos de proteínas, pero que esta represión suele ser relativamente leve (menos de 2 veces). [ 77 ] [ 78 ]

Los efectos de la desregulación de la expresión génica por miRNA parecen ser importantes en el cáncer. [ 79 ] Por ejemplo, en los cánceres gastrointestinales, se han identificado nueve miRNAs alterados epigenéticamente y eficaces en la regulación negativa de las enzimas de reparación del ADN. [ 80 ]

Los efectos de la desregulación de la expresión génica por miRNA también parecen ser importantes en trastornos neuropsiquiátricos, como la esquizofrenia, el trastorno bipolar, la depresión mayor, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer y los trastornos del espectro autista. [ 81 ] [ 82 ]

Traslacional

Estructura química de la molécula de neomicina.
La neomicina es un ejemplo de una molécula pequeña que reduce la expresión de todos los genes de proteínas, lo que inevitablemente conduce a la muerte celular; por lo tanto, actúa como un antibiótico .

La regulación directa de la traducción es menos frecuente que el control de la transcripción o la estabilidad del ARNm, pero se utiliza ocasionalmente. [ 83 ] La inhibición de la traducción de proteínas es un objetivo principal de toxinas y antibióticos , por lo que pueden matar una célula al anular su control normal de la expresión génica. [ 84 ] Entre los inhibidores de la síntesis de proteínas se incluyen el antibiótico neomicina y la toxina ricina . [ 85 ]

Modificaciones postraduccionales

Las modificaciones postraduccionales (MPT) son modificaciones covalentes de las proteínas. Al igual que el empalme de ARN, contribuyen a diversificar significativamente el proteoma. Estas modificaciones suelen estar catalizadas por enzimas. Además, procesos como las adiciones covalentes a los residuos de la cadena lateral de los aminoácidos a menudo pueden revertirse mediante otras enzimas. Sin embargo, algunas, como la escisión proteolítica del esqueleto proteico, son irreversibles. [ 86 ]

Las PTM desempeñan muchas funciones importantes en la célula. [ 87 ] Por ejemplo, la fosforilación participa principalmente en la activación y desactivación de proteínas y en las vías de señalización. [ 88 ] Las PTM participan en la regulación transcripcional: una función importante de la acetilación y la metilación es la modificación de la cola de las histonas, que altera la accesibilidad del ADN para la transcripción. [ 86 ] También se pueden observar en el sistema inmunitario, donde la glicosilación desempeña un papel clave. [ 89 ] Un tipo de PTM puede iniciar otro tipo de PTM, como se puede ver en cómo la ubiquitinación marca las proteínas para su degradación mediante proteólisis. [ 86 ] La proteólisis, además de participar en la degradación de proteínas, también es importante en su activación y desactivación, y en la regulación de procesos biológicos como la transcripción del ADN y la muerte celular. [ 90 ]

Medición

Cariograma esquemático de un ser humano , que muestra una visión general de la expresión del genoma humano mediante la tinción con bandas G , un método que incluye la tinción con Giemsa , en la que las regiones teñidas más claras son generalmente más activas transcripcionalmente , mientras que las regiones más oscuras son más inactivas.

La medición de la expresión génica es una parte importante de muchas ciencias biológicas , ya que la capacidad de cuantificar el nivel de expresión de un gen específico dentro de una célula, tejido u organismo puede proporcionar información muy valiosa. Por ejemplo, la medición de la expresión génica puede:

De igual modo, el análisis de la localización de la expresión proteica es una herramienta poderosa, que puede realizarse a nivel de organismo o célula. La investigación de la localización es particularmente importante para el estudio del desarrollo en organismos multicelulares y como indicador de la función proteica en células individuales. Idealmente, la medición de la expresión se realiza detectando el producto génico final (para muchos genes, este es la proteína); sin embargo, a menudo es más sencillo detectar uno de los precursores, generalmente el ARNm , e inferir los niveles de expresión génica a partir de estas mediciones.

cuantificación de ARNm

Los niveles de ARNm se pueden medir cuantitativamente mediante Northern blotting , que proporciona información sobre el tamaño y la secuencia de las moléculas de ARNm. [ 91 ] Una muestra de ARN se separa en un gel de agarosa y se hibrida con una sonda de ARN marcada radiactivamente que es complementaria a la secuencia diana. [ 92 ] El ARN radiomarcado se detecta mediante una autorradiografía . [ 93 ] Debido a que el uso de reactivos radiactivos hace que el procedimiento sea laborioso y potencialmente peligroso, se han desarrollado métodos alternativos de marcaje y detección, como las químicas de digoxigenina y biotina. [ 94 ] Las desventajas percibidas del Northern blotting son que se requieren grandes cantidades de ARN y que la cuantificación puede no ser completamente precisa, ya que implica medir la intensidad de la banda en una imagen de un gel. [ 95 ] Por otro lado, la información adicional sobre el tamaño del ARNm del Northern blotting permite la discriminación de transcritos con empalme alternativo. [ 96 ] [ 97 ]

Otro método para medir la abundancia de ARNm es la RT-qPCR. En esta técnica, la transcripción inversa va seguida de una PCR cuantitativa . La transcripción inversa genera primero una plantilla de ADN a partir del ARNm; esta plantilla monocatenaria se denomina ADNc . La plantilla de ADNc se amplifica posteriormente en la etapa cuantitativa, durante la cual la fluorescencia emitida por sondas de hibridación marcadas o colorantes intercalantes cambia a medida que avanza el proceso de amplificación del ADN . [ 98 ] Con una curva estándar cuidadosamente construida, la qPCR puede producir una medición absoluta del número de copias de ARNm original, generalmente en unidades de copias por nanolitro de tejido homogeneizado o copias por célula. [ 99 ] La qPCR es muy sensible (teóricamente es posible la detección de una sola molécula de ARNm), pero puede ser costosa dependiendo del tipo de marcador utilizado; las sondas de oligonucleótidos marcadas con fluorescencia son más caras que los colorantes fluorescentes intercalantes no específicos. [ 100 ]

Para el perfil de expresión , o análisis de alto rendimiento de muchos genes dentro de una muestra, se puede realizar PCR cuantitativa para cientos de genes simultáneamente en el caso de matrices de baja densidad. [ 101 ] Un segundo enfoque es el microarreglo de hibridación . Una sola matriz o "chip" puede contener sondas para determinar los niveles de transcripción para cada gen conocido en el genoma de uno o más organismos. [ 102 ] Alternativamente, se pueden utilizar tecnologías "basadas en etiquetas" como el análisis serial de la expresión génica (SAGE) y RNA-Seq , que pueden proporcionar una medida relativa de la concentración celular de diferentes ARNm. [ 103 ] Una ventaja de los métodos basados ​​en etiquetas es la "arquitectura abierta", que permite la medición exacta de cualquier transcrito, con una secuencia conocida o desconocida. [ 104 ] La secuenciación de próxima generación (NGS), como RNA-Seq, es otro enfoque, que produce grandes cantidades de datos de secuencia que se pueden comparar con un genoma de referencia. Aunque la secuenciación de nueva generación (NGS) es relativamente lenta, costosa y requiere muchos recursos, puede identificar polimorfismos de un solo nucleótido , variantes de empalme y genes nuevos, y también puede utilizarse para perfilar la expresión en organismos para los que se dispone de poca o ninguna información de secuencia. [ 105 ]

cuantificación de proteínas

En el caso de los genes que codifican proteínas, el nivel de expresión puede evaluarse directamente mediante diversos métodos que presentan claras analogías con las técnicas de cuantificación de ARNm.

Uno de los métodos más utilizados es realizar un Western blot contra la proteína de interés. [ 106 ] Esto proporciona información sobre el tamaño de la proteína además de su identidad. Una muestra (a menudo lisado celular ) se separa en un gel de poliacrilamida , se transfiere a una membrana y luego se incuba con un anticuerpo contra la proteína de interés. El anticuerpo puede estar conjugado a un fluoróforo o a peroxidasa de rábano picante para la obtención de imágenes y/o la cuantificación. La naturaleza basada en gel de este ensayo hace que la cuantificación sea menos precisa, pero tiene la ventaja de poder identificar modificaciones posteriores de la proteína, por ejemplo, proteólisis o ubiquitinación, a partir de cambios en el tamaño.

correlación ARNm-proteína

Si bien la transcripción refleja directamente la expresión génica, el número de copias de moléculas de ARNm no se correlaciona directamente con el número de moléculas de proteína traducidas a partir del ARNm. La cuantificación tanto de proteínas como de ARNm permite correlacionar ambos niveles. La regulación en cada paso de la expresión génica puede afectar la correlación, como se ha demostrado para la regulación de la traducción [ 27 ] o la estabilidad de las proteínas [ 107 ] . Los factores postraduccionales, como el transporte de proteínas en células altamente polares [ 108 ] , también pueden influir en la correlación medida entre el ARNm y las proteínas.

Localización

Visualización del ARNm de hunchback en un embrión de Drosophila.
Hibridación in situ de embriones de Drosophila en diferentes etapas de desarrollo para el ARNm responsable de la expresión de hunchback . La alta intensidad del color azul marca las zonas con alta cantidad de ARNm de hunchback.

El análisis de la expresión no se limita a la cuantificación; también permite determinar la localización. El ARNm se puede detectar con una cadena de ARNm complementaria debidamente marcada, y las proteínas mediante anticuerpos marcados. Posteriormente, la muestra analizada se observa al microscopio para identificar la ubicación del ARNm o la proteína.

Diagrama de cinta de la proteína fluorescente verde que se asemeja a una estructura de barril.
Estructura tridimensional de la proteína fluorescente verde . Los residuos en el centro del "barril" son responsables de la producción de luz verde tras la exposición a luz azul de mayor energía. Fuente: PDB : 1EMA .

Al reemplazar el gen con una nueva versión fusionada a una proteína fluorescente verde ( GFP) o similar, la expresión puede cuantificarse directamente en células vivas. Esto se logra mediante la obtención de imágenes con un microscopio de fluorescencia . Es muy difícil clonar una proteína fusionada con GFP en su ubicación nativa en el genoma sin afectar los niveles de expresión, por lo que este método a menudo no puede utilizarse para medir la expresión de genes endógenos. Sin embargo, se utiliza ampliamente para medir la expresión de un gen introducido artificialmente en la célula, por ejemplo, mediante un vector de expresión . Al fusionar una proteína diana con un marcador fluorescente, el comportamiento de la proteína, incluyendo su localización celular y nivel de expresión, puede modificarse significativamente.

El ensayo inmunoenzimático (ELISA) funciona mediante anticuerpos inmovilizados en una placa de microtitulación para capturar las proteínas de interés de las muestras añadidas al pocillo. Utilizando un anticuerpo de detección conjugado a una enzima o fluoróforo, la cantidad de proteína unida se puede medir con precisión mediante detección fluorométrica o colorimétrica . El proceso de detección es muy similar al de un Western blot, pero al evitar los pasos de electroforesis en gel, se logra una cuantificación más precisa.

Véase también

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