Inyección genética

En clonación molecular y biología , un knock-in (abreviatura: KI ) se refiere a un método de ingeniería genética que implica la sustitución uno a uno de información de secuencia de ADN en un locus genético o la inserción de información de secuencia que no se encuentra dentro del locus. ^{[ 1 ]} Normalmente, esto se hace en ratones, ya que la tecnología para este proceso es más refinada y existe un alto grado de complejidad de secuencia compartida entre ratones y humanos. ^{[ 2 ]} La diferencia entre la tecnología knock-in y las técnicas transgénicas tradicionales es que un knock-in implica un gen insertado en un locus específico y, por lo tanto, es una inserción "dirigida". Es lo opuesto a la eliminación de genes .

Una aplicación común de la tecnología de inserción génica es la creación de modelos de enfermedades. Se trata de una técnica que permite a los investigadores científicos estudiar la función de la maquinaria reguladora (por ejemplo, los promotores ) que controla la expresión del gen natural que se reemplaza. Esto se logra observando el nuevo fenotipo del organismo en cuestión. En este caso, se utilizan BAC y YAC para transferir fragmentos de gran tamaño.

La inserción génica se originó como una ligera modificación de la técnica de inactivación génica original desarrollada por Martin Evans , Oliver Smithies y Mario Capecchi . Tradicionalmente, las técnicas de inserción génica se han basado en la recombinación homóloga para impulsar el reemplazo génico dirigido, aunque se han desarrollado otros métodos que utilizan un sistema mediado por transposones para insertar el gen objetivo. ^{[ 3 ]} El uso de sitios flanqueantes loxP que se escinden tras la expresión de la recombinasa Cre con vectores génicos es un ejemplo de esto. Las células madre embrionarias con la modificación de interés se implantan en un blastocisto viable , que se desarrollará en un ratón quimérico maduro con algunas células que poseen la información genética de la célula del blastocisto original y otras células que poseen las modificaciones introducidas en las células madre embrionarias. La descendencia posterior del ratón quimérico tendrá la inserción génica. ^{[ 4 ]}

La inserción génica ha permitido, por primera vez, realizar estudios basados ​​en hipótesis sobre modificaciones genéticas y fenotipos resultantes. Por ejemplo, se pueden inducir mutaciones en el gen humano p53 mediante la exposición al benzo(a)pireno (BaP), y la copia mutada del gen p53 puede insertarse en el genoma de ratones. Los tumores pulmonares observados en los ratones con la inserción génica respaldan la hipótesis de la carcinogenicidad del BaP . ^{[ 5 ]} Los avances más recientes en la técnica de inserción génica han permitido insertar en cerdos un gen para la proteína verde fluorescente mediante el sistema CRISPR/Cas9 , lo que posibilita inserciones genéticas mucho más precisas y exitosas. ^{[ 6 ]} La velocidad de la inserción génica mediada por CRISPR/Cas9 también permite generar modificaciones bialélicas en algunos genes y observar el fenotipo en ratones en una sola generación, un plazo sin precedentes. ^{[ 7 ]}

La tecnología de inserción génica (knock-in) se diferencia de la tecnología de eliminación génica (knock-out) en que esta última busca eliminar parte de la secuencia de ADN o insertar información irrelevante para interrumpir la expresión de un locus genético específico. La tecnología de inserción génica, por otro lado, altera el locus genético de interés mediante la sustitución uno a uno de la información de la secuencia de ADN o mediante la adición de información que no se encuentra en dicho locus. Por lo tanto, una inserción génica puede considerarse una mutación de ganancia de función y una eliminación génica una mutación de pérdida de función , pero una inserción génica también puede implicar la sustitución de un locus génico funcional por un fenotipo mutante que resulta en alguna pérdida de función. ^{[ 8 ]}

Debido al éxito de los métodos de inserción génica hasta la fecha, se pueden prever numerosas aplicaciones clínicas. Se ha demostrado que la inserción de secciones del gen de la inmunoglobulina humana en ratones permite la producción de anticuerpos humanizados con utilidad terapéutica. ^{[ 9 ]} Debería ser posible modificar células madre humanas para restaurar la función de genes específicos en determinados tejidos; por ejemplo, posiblemente corrigiendo el gen mutante de la cadena gamma del receptor de IL-2 en células madre hematopoyéticas para restaurar el desarrollo ^de linfocitos en personas con inmunodeficiencia combinada grave ligada al cromosoma X. [ ^{4 ]}

Aunque la tecnología de inserción génica ha demostrado ser una técnica poderosa para la generación de modelos de enfermedades humanas y la comprensión de las proteínas in vivo , aún existen numerosas limitaciones. Muchas de ellas son compartidas con las limitaciones de la tecnología de eliminación génica. En primer lugar, las combinaciones de genes insertados conducen a una creciente complejidad en las interacciones que los genes insertados y sus productos tienen con otras secciones del genoma y, por lo tanto, pueden generar más efectos secundarios y fenotipos difíciles de explicar . Además, solo unos pocos loci, como el locus ROSA26 , se han caracterizado lo suficientemente bien como para poder utilizarse para la inserción génica condicional; lo que hace problemáticas las combinaciones de genes reporteros y transgenes en el mismo locus. La mayor desventaja de utilizar la inserción génica para la generación de modelos de enfermedades humanas es que la fisiología del ratón no es idéntica a la de los humanos y los ortólogos humanos de las proteínas expresadas en ratones a menudo no reflejarán completamente la función de un gen en la patología humana. ^{[ 10 ]} Esto se puede observar en ratones producidos con la mutación de fibrosis ΔF508 en el gen CFTR , que representa más del 70% de las mutaciones en este gen en la población humana y conduce a la fibrosis quística . Si bien los ratones CF ΔF508 exhiben los defectos de procesamiento característicos de la mutación humana, no muestran los cambios fisiopatológicos pulmonares observados en humanos y prácticamente no presentan fenotipo pulmonar. ^{[ 11 ]} Estos problemas podrían mitigarse mediante el uso de diversos modelos animales, y se han generado modelos porcinos (los pulmones de cerdo comparten muchas similitudes bioquímicas y fisiológicas con los pulmones humanos) en un intento de explicar mejor la actividad de la mutación ΔF508. ^{[ 12 ]}

• Eliminación genética
• Ingeniería genética
• Recombinación genética
• Clonación molecular
• Plásmido
• Vector (biología molecular)

• Métodos, técnicas y protocolos genéticos
• Instituto Koch para la Investigación Integrativa del Cáncer en el MIT: Knockins y Knockouts
• Software de redes de investigación UMass Profiles: Técnicas de inserción genética : una herramienta de software para la creación de redes de investigación y la búsqueda de conocimientos especializados.
• http://www.transgenic.co.jp/en/products/mice-service/modified_mouse/knockin.php Archivado el 27/04/2020 en Wayback Machine : describe el proceso de construcción de vectores de inserción y cría de ratones.