Hispanopedia WikiLa recombinación Cre-Lox es una tecnología de recombinasa sitio-específica que se utiliza para realizar deleciones , inserciones , translocaciones e inversiones en sitios específicos del ADN celular. Permite dirigir la modificación del ADN a un tipo celular específico o activarla mediante un estímulo externo concreto. Se implementa tanto en sistemas eucariotas como procariotas . El sistema de recombinación Cre-Lox ha sido especialmente útil para ayudar a los neurocientíficos a estudiar el cerebro, donde complejos tipos celulares y circuitos neuronales se combinan para generar la cognición y el comportamiento. El programa NIH Blueprint for Neuroscience Research ha creado cientos de líneas de ratones transgénicos Cre que actualmente utiliza la comunidad neurocientífica mundial.
Una aplicación importante del sistema Cre-lox es la escisión de marcadores seleccionables en la recombinación genética. Las estrategias de recombinación genética comúnmente utilizadas introducen marcadores seleccionables en el genoma para facilitar la selección de mutaciones genéticas que pueden causar retraso del crecimiento. Sin embargo, la expresión de los marcadores puede tener efectos polares en la expresión de genes anteriores y posteriores. La eliminación de marcadores seleccionables del genoma mediante recombinación Cre-lox es una forma elegante y eficiente de sortear este problema y, por lo tanto, se utiliza ampliamente en plantas, líneas celulares de ratón, levaduras, etc. [ 1 ]
El sistema consta de una sola enzima, la recombinasa Cre , que recombina un par de secuencias objetivo cortas llamadas secuencias Lox . Este sistema puede implementarse sin insertar proteínas o secuencias de soporte adicionales. La enzima Cre y el sitio Lox original, denominado secuencia LoxP , derivan del bacteriófago P1 .
La colocación adecuada de secuencias Lox permite activar, reprimir o intercambiar genes. A nivel de ADN, se pueden realizar diversos tipos de manipulaciones. La actividad de la enzima Cre puede controlarse para que se exprese en un tipo celular específico o se active mediante un estímulo externo, como una señal química o un choque térmico. Estas modificaciones dirigidas del ADN son útiles para el rastreo del linaje celular y cuando la expresión generalizada de mutantes resulta letal.
El sistema Cre-Lox es muy similar en funcionamiento y uso al sistema de recombinación FLP-FRT . [ 2 ]
Historia
La recombinación Cre-Lox es un tipo especial de recombinación sitio-específica desarrollada por el Dr. Brian Sauer y patentada por DuPont , que operaba en células mitóticas en división y se utilizó inicialmente para activar la expresión génica en líneas celulares de mamíferos. [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ] Posteriormente, investigadores del laboratorio del Dr. Jamey Marth demostraron que la recombinación Cre-Lox podía utilizarse para eliminar secuencias de ADN cromosómico flanqueadas por loxP con alta eficiencia en células T específicas en desarrollo de animales transgénicos. Los autores propusieron que este enfoque podría utilizarse para definir la función de genes endógenos en tipos celulares específicos, marcar de forma indeleble a los progenitores en estudios de determinación del destino celular , inducir reordenamientos cromosómicos específicos para modelos biológicos y de enfermedades, y determinar las funciones de las lesiones genéticas tempranas en el mantenimiento de enfermedades (y fenotipos). [ 6 ]
Poco después, investigadores del laboratorio del Prof. Klaus Rajewsky informaron sobre la producción de células madre embrionarias pluripotentes que portaban un gen de ADN polimerasa flanqueado por loxP (floxed) dirigido. [ 7 ] Combinando estos avances en colaboración, los laboratorios de los Dres. Marth y Rajewsky informaron en 1994 que la recombinación Cre-lox podría usarse para la focalización génica condicional . [ 8 ] Observaron que ≈50% del gen beta de la ADN polimerasa se eliminó en las células T según el análisis de transferencia de ADN. No estaba claro si solo un alelo en cada célula T o el 50% de las células T tenían una eliminación del 100% en ambos alelos. Desde entonces, los investigadores han informado de una mutagénesis génica condicional Cre-Lox más eficiente en las células T en desarrollo por el laboratorio de Marth en 1995. [ 9 ] La eliminación incompleta por la recombinasa Cre no es infrecuente en células cuando existen dos copias de secuencias floxadas, y permite la formación y el estudio de tejidos quiméricos. Se ha demostrado que todos los tipos de células probados en ratones experimentan recombinación transgénica Cre. Sin embargo, dado que la recombinación de ADN solo ocurre en las células en división, como se enseña típicamente en las aulas y se escribe en los libros de texto de biología, no está claro si la recombinación de ADN mediada por Cre-lox funcionaría en las células posmitóticas que no se dividen.
De forma independiente, Joe Z. Tsien, del MIT, ha sido pionero en el uso del sistema Cre-loxP para la manipulación genética específica de tipo celular y región en el cerebro adulto, donde pueden existir cientos de tipos distintos de neuronas y se sabe que casi todas las neuronas del cerebro adulto son posmitóticas. [ 10 ] Tsien y sus colegas demostraron que la recombinación mediada por Cre puede ocurrir en las neuronas piramidales posmitóticas del prosencéfalo del ratón adulto. [ 11 ]
Estos avances han llevado a un uso generalizado de la mutagénesis condicional en la investigación biomédica, abarcando muchas disciplinas en las que se convierte en una plataforma poderosa para determinar la función de los genes en tipos celulares específicos y en momentos específicos del desarrollo. En particular, la clara demostración de su utilidad para definir con precisión la compleja relación entre células/circuitos específicos y comportamientos para la investigación cerebral, [ 12 ] ha impulsado a los NIH a iniciar los proyectos de ratones Cre-driver del NIH Blueprint for Neuroscience Research a principios del año 2000. [ 13 ] [ 14 ] Hasta la fecha, los proyectos Cre del NIH Blueprint for Neuroscience Research han creado varios cientos de líneas de ratones Cre driver que actualmente utiliza la comunidad neurocientífica mundial.
Descripción general
La recombinación Cre-Lox implica la selección de una secuencia específica de ADN y su empalme con la ayuda de una enzima llamada recombinasa Cre . La recombinación Cre-Lox se utiliza comúnmente para evitar la letalidad embrionaria causada por la inactivación sistémica de muchos genes. [ 15 ] [ 16 ] A febrero de 2019, la recombinación Cre-Lox es una herramienta poderosa y se utiliza en modelos animales transgénicos para vincular genotipos con fenotipos. [ 12 ] [ 17 ] [ 18 ]
El sistema Cre-lox se utiliza como herramienta genética para controlar eventos de recombinación específicos en el ADN genómico. Este sistema ha permitido a los investigadores manipular diversos organismos genéticamente modificados para controlar la expresión génica, eliminar secuencias de ADN no deseadas y modificar la arquitectura cromosómica. [ 19 ]
La proteína Cre es una recombinasa de ADN específica de sitio que cataliza la recombinación de ADN entre sitios específicos en una molécula de ADN. Estos sitios, conocidos como secuencias loxP , contienen sitios de unión específicos para Cre que rodean una secuencia central direccional donde puede ocurrir la recombinación.
Cuando las células que poseen sitios loxP en su genoma expresan Cre, puede ocurrir un evento de recombinación entre dichos sitios . Las proteínas recombinasas Cre se unen a las regiones de 13 pares de bases (pb) inicial y final de un sitio lox, formando un dímero . Este dímero se une a otro dímero en un sitio lox diferente para formar un tetrámero . Los sitios lox son direccionales, y los dos sitios unidos por el tetrámero tienen una orientación paralela. La proteína Cre corta el ADN de doble cadena en ambos sitios loxP . Posteriormente, las cadenas se vuelven a unir mediante la ligasa de ADN en un proceso rápido y eficiente. El resultado de la recombinación depende de la orientación de los sitios loxP . Si dos sitios lox se encuentran en el mismo brazo cromosómico, los sitios loxP invertidos provocarán una inversión del ADN intermedio, mientras que una repetición directa de sitios loxP causará una deleción. Si los sitios loxP se encuentran en cromosomas diferentes, es posible que la recombinación inducida por Cre catalice eventos de translocación . Se pueden unir dos plásmidos utilizando los sitios lox variantes 71 y 66. [ 20 ]
recombinasa Cre
La recombinasa Cre puede ser sintetizada por el gen correspondiente bajo la dirección de promotores específicos de células, incluyendo promotores bajo el control de la doxiciclina. Se puede lograr un nivel adicional de control utilizando la recombinasa Cre his, diseñada para activarse reversiblemente en presencia del análogo de estrógeno 4-hidroxi tamoxifeno. Esto ofrece la ventaja de que la recombinasa Cre permanece activa durante un corto período de tiempo, lo que previene acciones inespecíficas de la misma. La recombinasa Cre puede reconocer sitios crípticos en el genoma del huésped e inducir recombinación no autorizada, dañando el ADN del huésped. Esta herramienta es adecuada para eliminar genes de resistencia a antibióticos, pero sobre todo permite la eliminación condicional de genes que pueden inducirse en momentos específicos en el tipo celular deseado. Los modelos así obtenidos tienen mayor probabilidad de imitar la situación fisiológica. [ 21 ]
La proteína Cre (codificada por el locus originalmente denominado "Causa la recombinación", aunque en algunas referencias aparece como "Recombinasa de ciclación") [ 22 ] [ 23 ] consta de 4 subunidades y dos dominios: el dominio carboxilo ( C-terminal ), de mayor tamaño, y el dominio amino ( N-terminal ), de menor tamaño. La proteína total tiene 343 aminoácidos . El dominio C es similar en estructura al dominio de la familia de enzimas integrasa aisladas del fago lambda . Este es también el sitio catalítico de la enzima.
sitio loxP
loxP (locus de X-over P1) es un sitio en el bacteriófago P1 que consta de 34 pb . El sitio incluye una secuencia asimétrica de 8 pb, variable excepto por las dos bases centrales, entre dos conjuntos de secuencias simétricas de 13 pb. La secuencia exacta se muestra a continuación; 'N' indica las bases que pueden variar, y las letras minúsculas indican las bases que han mutado con respecto al tipo silvestre. Las secuencias de 13 pb son palindrómicas, pero el espaciador de 8 pb no lo es, lo que le da a la secuencia loxP una dirección determinada. Generalmente, los sitios loxP vienen en pares para manipulación genética. Si los dos sitios loxP están en la misma orientación, la secuencia floxada (secuencia flanqueada por dos sitios loxP ) se escinde; sin embargo, si los dos sitios loxP están en orientación opuesta, la secuencia floxada se invierte. Si existe una secuencia donante floxada, la secuencia donante se puede intercambiar con la secuencia original. Esta técnica se denomina intercambio de casetes mediado por recombinasa y es una forma muy práctica y rápida de manipulación genética. Sin embargo, el inconveniente es que la reacción de recombinación puede ocurrir en sentido inverso, lo que hace que el intercambio de casetes sea ineficiente. Además, la escisión de la secuencia puede ocurrir en trans en lugar de un intercambio de casetes en cis . Los mutantes loxP se crean para evitar estos problemas. [ 24 ]
Uniones de Holliday y recombinación homóloga
Durante la recombinación genética, se forma una unión de Holliday entre las dos hebras de ADN y una rotura de doble cadena en una molécula de ADN deja expuesto un extremo 3' OH. Esta reacción es facilitada por la actividad endonucleasa de una enzima. Los extremos 5' fosfato suelen ser los sustratos de esta reacción, por lo que quedan regiones 3' extendidas. Este grupo 3' OH es altamente inestable, y la hebra en la que está presente debe encontrar su complemento. Dado que la recombinación homóloga ocurre después de la replicación del ADN, hay dos hebras de ADN disponibles, por lo que el grupo 3' OH debe aparearse con su complemento, y lo hace, con una hebra intacta en la otra doble hélice. Ahora, se ha producido un punto de entrecruzamiento, que es lo que se denomina un intermedio de Holliday.
El extremo 3' OH se alarga (es decir, se añaden bases) con la ayuda de la ADN polimerasa. El apareamiento de las hebras opuestas constituye el entrecruzamiento o recombinación, un evento común a todos los organismos vivos, ya que el material genético de una hebra de una doble hélice se ha apareado con una hebra de otra doble hélice y ha sido alargado por la ADN polimerasa. La posterior escisión de los intermediarios de Holliday da como resultado la formación de ADN híbrido.
Esta posterior escisión o "resolución" la lleva a cabo un grupo especial de enzimas llamadas resolvasas. RuvC es solo una de estas resolvasas que se han aislado en bacterias y levaduras.
Durante muchos años, se pensó que, al formarse el intermedio de unión de Holliday, el punto de ramificación de la unión (donde se cruzan las hebras) se ubicaría en el primer sitio de escisión. La migración del punto de ramificación al segundo sitio de escisión desencadenaría, de alguna manera, la segunda mitad de la vía. Este modelo proporcionaba una explicación conveniente para el estricto requisito de homología entre los sitios de recombinación, ya que la migración de la ramificación se detendría en un desajuste y no permitiría que ocurriera el segundo intercambio de hebras. Sin embargo, en los últimos años, esta visión ha sido cuestionada, y la mayoría de los modelos actuales para la recombinación Int, Xer y Flp implican solo una migración de ramificación limitada (1-3 pares de bases del intermedio de Holliday), acoplada a un evento de isomerización que es responsable de cambiar la especificidad de la escisión de la hebra.
Recombinación específica del sitio
La recombinación sitio-específica (SSR) implica sitios específicos para la acción catalítica de enzimas especiales llamadas recombinasas. La Cre, o recombinasa cíclica, es una de estas enzimas. Por lo tanto, la recombinación sitio-específica es la escisión y ligación, mediada por enzimas, de dos secuencias definidas de desoxinucleótidos.
Se han descrito varios sistemas de recombinación sitio-específica conservados tanto en organismos procariotas como eucariotas. En general, estos sistemas utilizan una o más proteínas y actúan sobre secuencias de ADN asimétricas únicas. Los productos de la recombinación dependen de la orientación relativa de estas secuencias asimétricas. Además de la recombinasa, muchas otras proteínas participan en la regulación de la reacción. Durante la recombinación de ADN sitio-específica, que produce reordenamientos genéticos en procesos como la integración y escisión viral y la segregación cromosómica, estas enzimas recombinasas reconocen secuencias de ADN específicas y catalizan el intercambio recíproco de hebras de ADN entre estos sitios.
Mecanismo de acción
La recombinación sitio-específica se inicia con la unión de las proteínas de recombinación a sus respectivas dianas de ADN. Una recombinasa diferente reconoce y se une a cada uno de los dos sitios de recombinación en dos moléculas de ADN distintas o dentro de la misma hebra de ADN. En el sitio específico del ADN, el grupo hidroxilo de la tirosina de la recombinasa ataca un grupo fosfato en la cadena principal del ADN mediante un mecanismo de transesterificación directa . Esta reacción une la proteína recombinasa al ADN a través de un enlace fosfotirosina. Esto conserva la energía del enlace fosfodiéster, lo que permite que la reacción se revierta sin la intervención de un cofactor de alta energía.
La escisión en la otra hebra también provoca la formación de un enlace fosfotirosina entre el ADN y la enzima. En ambos dúplex de ADN, la unión del grupo fosfato a los residuos de tirosina deja un grupo 3' OH libre en la cadena principal del ADN. De hecho, el complejo enzima-ADN es una etapa intermedia, seguida de la ligación del grupo 3' OH de una hebra de ADN al grupo fosfato 5' de la otra hebra, que está unido covalentemente al residuo de tirosina; es decir, se rompe el enlace covalente entre el extremo 5' y el residuo de tirosina. Esta reacción sintetiza la unión de Holliday descrita anteriormente.
De esta forma, se unen las hebras opuestas del ADN. La posterior escisión y reunificación provoca que las hebras intercambien segmentos. Las interacciones proteína-proteína impulsan y dirigen este intercambio. La energía no se ve comprometida, ya que el enlace proteína-ADN compensa la pérdida del enlace fosfodiéster que se produce durante la escisión.
La recombinación sitio-específica es un proceso importante que los virus, como los bacteriófagos, emplean para integrar su material genético en el huésped infectado. En este estado, el virus, denominado profago , logra esto mediante la integración y la escisión. Los puntos donde ocurren estas reacciones se conocen como sitios de unión (att). Un sitio attP del fago intercambia segmentos con un sitio attB del ADN bacteriano. Por lo tanto, estos procesos son sitio-específicos y ocurren únicamente en los sitios att correspondientes. Las enzimas de la clase integrasa catalizan esta reacción.
Eficiencia de la acción
Se ha demostrado que dos factores afectan la eficiencia de la escisión de Cre en el par lox. Primero, la identidad de la secuencia de nucleótidos en la región espaciadora del sitio lox. Las variantes de lox modificadas que difieren en la región espaciadora tienden a tener una eficiencia de recombinación variable, pero generalmente menor, en comparación con loxP de tipo silvestre , presumiblemente al afectar la formación y resolución del intermedio de recombinación. [ 27 ]
Otro factor es la longitud del ADN entre el par lox. Aumentar la longitud del ADN conduce a una menor eficiencia de la recombinación Cre/lox posiblemente a través de la regulación de la dinámica de la reacción. [ 28 ] [ 29 ] [ 30 ] La ubicación genética de la secuencia floxada también afecta la eficiencia de la recombinación probablemente al influir en la disponibilidad de ADN por la recombinasa Cre . [ 30 ] La elección del controlador Cre también es importante ya que la baja expresión de la recombinasa Cre tiende a resultar en una recombinación no paralela. La recombinación no paralela es especialmente problemática en un escenario de mapeo de destino donde un evento de recombinación está diseñado para manipular el gen en estudio y el otro evento de recombinación es necesario para activar un gen reportero (generalmente codificando una proteína fluorescente) para el rastreo del linaje celular . [ 30 ] No activar ambos eventos de recombinación simultáneamente confunde la interpretación de los resultados del mapeo de destino celular .
Control temporal
La activación inducible de Cre se logra utilizando una variante de CreER (receptor de estrógeno), que solo se activa después de la administración de tamoxifeno . [ 31 ] Esto se realiza mediante la fusión de un dominio de unión a ligando mutado del receptor de estrógeno a la recombinasa Cre, lo que resulta en que Cre se active específicamente por el tamoxifeno. En ausencia de tamoxifeno, CreER provocará el traslado de la recombinasa mutada al citoplasma. La proteína permanecerá en esta ubicación en su estado inactivado hasta que se administre tamoxifeno. Una vez introducido el tamoxifeno, se metaboliza en 4-hidroxitamoxifeno, que luego se une al ER y produce la translocación de CreER al núcleo, donde puede escindir los sitios lox. [ 32 ] Es importante destacar que, en ocasiones, los reporteros fluorescentes pueden activarse en ausencia de tamoxifeno, debido a la fuga de algunas moléculas de recombinasa Cre al núcleo, lo que, en combinación con reporteros muy sensibles, produce un marcaje celular no deseado. [ 33 ] CreER(T2) se desarrolló para minimizar la recombinación independiente del tamoxifeno y maximizar la sensibilidad al tamoxifeno.
Rastreo condicional del linaje celular
Las células alteran su fenotipo en respuesta a numerosos estímulos ambientales y pueden perder la expresión de genes que normalmente marcan su identidad, lo que dificulta la investigación de la contribución de ciertos tipos celulares a las enfermedades. Por lo tanto, los investigadores suelen utilizar ratones transgénicos que expresan la recombinasa CreER t2 inducida por la administración de tamoxifeno, bajo el control de un promotor de un gen que marca el tipo celular específico de interés, con una proteína fluorescente reportera dependiente de Cre. La recombinasa Cre está fusionada a una forma mutante del receptor de estrógeno, que se une al estrógeno sintético 4-hidroxitamoxifeno en lugar de a su ligando natural 17β-estradiol. CreER(T2) reside en el citoplasma y solo puede translocarse al núcleo tras la administración de tamoxifeno, lo que permite un control temporal preciso de la recombinación. El casete reportero fluorescente contendrá un promotor para permitir una alta expresión del transgén reportero fluorescente (por ejemplo, un promotor CAG) y un casete de parada flanqueado por loxP, asegurando que la expresión del transgén dependa de la recombinasa Cre y de la secuencia reportera. Tras la recombinación impulsada por Cre, el casete de parada se escinde, permitiendo que los genes reporteros se expresen específicamente en las células en las que la expresión de Cre está siendo impulsada por el promotor marcador específico de la célula. Dado que la eliminación del casete de parada es permanente, los genes reporteros se expresan en toda la progenie producida por las células iniciales donde Cre se activó una vez. Este rastreo de linaje condicional ha demostrado ser extremadamente útil para identificar de manera eficiente y específica las células musculares lisas vasculares (CMLV) y las células derivadas de CMLV, y se ha utilizado para probar los efectos sobre las CMLV y las células derivadas de CMLV in vivo. [ 34 ] [ 35 ] [ 36 ] [ 37 ] [ 38 ] [ 39 ]
Función natural del sistema Cre-lox
El fago P1 es un fago templado que, al infectar una bacteria, provoca un ciclo lisogénico o lítico . En su fase lítica, una vez que su genoma viral se inyecta en la célula huésped, se producen proteínas virales, se ensamblan viriones y la célula huésped se lisa, liberando así los fagos y continuando el ciclo. En el ciclo lisogénico, el genoma del fago se replica junto con el resto del genoma bacteriano y se transmite a las células hijas en cada división celular posterior. Puede pasar a la fase lítica por un evento posterior, como la radiación ultravioleta o la inanición.
Los fagos como el fago lambda utilizan sus recombinasas específicas de sitio para integrar su ADN en el genoma del huésped durante la lisogenia. El ADN del fago P1, por otro lado, existe como un plásmido en el huésped. El sistema Cre-lox cumple varias funciones en el fago: circulariza el ADN del fago en un plásmido, separa los anillos de plásmidos interconectados para que se transmitan equitativamente a ambas bacterias hijas y puede ayudar a mantener el número de copias mediante un medio alternativo de replicación. [ 40 ]
El ADN del fago P1, al ser liberado del virión al huésped, se presenta como una molécula de ADN bicatenario lineal. La enzima Cre se dirige a los sitios loxP en los extremos de esta molécula y cicla el genoma. Este proceso también puede ocurrir en ausencia del sistema Cre-lox [ 41 ] con la ayuda de otras proteínas bacterianas y virales. El plásmido P1 es relativamente grande (≈90 kbp) y, por lo tanto, existe en un número bajo de copias, generalmente una por célula. Si los dos plásmidos hijos se entrelazan, una de las células hijas del huésped perderá el plásmido. El sistema de recombinación Cre-lox previene estas situaciones al separar los anillos de ADN mediante dos eventos de recombinación (anillos unidos -> anillo fusionado -> dos anillos separados). También se propone que la replicación en círculo rodante seguida de recombinación permite que el plásmido aumente su número de copias cuando ciertos reguladores (repA) son limitantes [ 40 ] .
Implementación de múltiples pares de sitios loxP
Una estrategia clásica para generar variantes de deleción génica se basa en la doble integración cruzada de vectores no replicantes en el genoma. Además, los sistemas de recombinación como Cre-lox se utilizan ampliamente, sobre todo en eucariotas. Las propiedades versátiles de la recombinasa Cre la hacen ideal para su uso en numerosas estrategias de ingeniería genética. Por ello, el sistema Cre-lox se ha utilizado en una amplia variedad de eucariotas, incluidas las plantas. [ 42 ]
Múltiples variantes de loxP , [ 43 ] en particular lox2272 y loxN, han sido utilizadas por investigadores con la combinación de diferentes acciones de Cre (transitorias o constitutivas) para crear un sistema " Brainbow " que permite la coloración multicolor del cerebro de ratones con cuatro proteínas fluorescentes.
Otro informe utiliza un par de variantes de lox, pero al regular la longitud del ADN en un par, da como resultado una activación génica estocástica con un nivel de dispersión regulado. [ 28 ]
Notas y referencias
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Enlaces externos
- Introducción a la tecnología Cre-lox por el "Laboratorio Jackson". Archivado el 9 de octubre de 2009 en Wayback Machine.
- Genética molecular
- ADN
- Ingeniería genética
- Técnicas genéticas
