Geosmina sintasa

La geosmina sintasa tiene aproximadamente 726 aminoácidos de longitud y posee dos sitios activos distintivos en las mitades N-terminal y C-terminal, respectivamente (en S. coelicor, el dominio N-terminal consta de los aminoácidos 1-319, mientras que el dominio C-terminal existe desde el 374-726), ambos similares a la sintasa de sesquiterpenos pentaleneno sintasa . ^{[ 5 ] [ 11 ]} Tanto la mitad N-terminal como la C-terminal de la sintasa contienen dominios ricos en aspartato (DDHFLE y DDYYP, respectivamente) y el motivo de aminoácidos NSE (NDLFSYQRE y NDVFSYQKE, respectivamente), que se unen al magnesio trinuclear . ^{[ 5 ] [ 12 ]} El magnesio es un cofactor necesario , sin el cual la sintasa muestra una completa falta de actividad catalítica. ^{[ 5 ]}

En experimentos donde se incubó FPP con geosmina sintasa recombinante, el aumento de la concentración de la sintasa o del tiempo de incubación resultó en un incremento absoluto y relativo de geosmina en comparación con el intermediario germacradienol; esto demuestra que la geosmina sintasa no actúa exclusivamente sobre una serie de intermediarios unidos a la enzima. En cambio, el germacradienol se libera del dominio N-terminal y luego se vuelve a unir al dominio C-terminal para su conversión final en geosmina. ^{[ 5 ]}

La mutagénesis dirigida de los sitios de unión de magnesio N-terminales dio como resultado una enzima incapaz de convertir FPP en germacradienol y germacreno D. ^{[ 5 ]} La mutagénesis dirigida de los sitios de unión de magnesio C-terminales dio como resultado una enzima incapaz de catalizar la segunda mitad de la reacción de germacradienol a geosmina, pero aún capaz de convertir FPP en germacradienol y germacreno D. ^{[ 5 ]} Los mutantes truncados de solo las mitades N-terminal o C-terminal de la geosmina sintasa también son capaces de catalizar sus respectivas reacciones, lo que proporciona más evidencia de que las mitades N- y C-terminal de la geosmina sintasa son esencialmente dos enzimas distintas e independientes. ^{[ 5 ]}

La mitad N-terminal de la geosmina sintasa contiene un segundo motivo NSE de unión al magnesio, aproximadamente 38 residuos después del primero. ^{[ 5 ]} La mutagénesis dirigida de este motivo NSE repetido no altera significativamente la actividad catalítica de la sintasa, lo que sugiere que no cumple ninguna función. ^{[ 5 ]} Este motivo repetido posterior está bien conservado en otras geosmina sintasas conocidas o putativas, lo que sugiere que tiene una función aún no descubierta o que puede ser un vestigio del desarrollo evolutivo. ^{[ 5 ]}

El primer paso en el mecanismo es que el doble enlace carbono-carbono del FPP más alejado del grupo difosfato ataque al carbono adyacente al difosfato, formando un carbocatión cíclico con la pérdida del grupo difosfato. ^{[ 5 ] [ 13 ]} Un desplazamiento de hidruro 1,3 mueve el carbocatión más cerca del doble enlace carbono-carbono más próximo; la pérdida de un protón forma un nuevo doble enlace carbono-carbono y permite que el doble enlace carbono-carbono adyacente al carbocatión desactive este grupo cargado, formando el subproducto germacreno D. ^{[ 5 ] [ 13 ]} Alternativamente, el carbocatión producido en el primer paso puede perder inmediatamente un protón para formar el intermedio isolepidozeno , que posteriormente es atacado por agua para formar germacradienol. ^{[ 5 ] [ 13 ]} El procesamiento posterior del germacradienol implica una ciclación iniciada por protón y una novedosa fragmentación de tipo retro-Prins que produce el intermedio octalina y el subproducto acetona . Finalmente, la protonación, un desplazamiento de hidruro 1,2 y la desactivación por agua convierten la octalina en geosmina. ^{[ 5 ] [ 10 ] [ 14 ]}