Ribozima del virus de la hepatitis delta

La ribozima del virus de la hepatitis delta (VHD) es un ARN no codificante presente en el virus de la hepatitis delta, esencial para su replicación. El virus de la hepatitis delta es el único virus humano conocido que utiliza la actividad de la ribozima para infectar a su huésped. ^{[ 1 ]} La ribozima procesa los transcritos de ARN en longitudes unitarias mediante una reacción de autocorte durante la replicación del virus de la hepatitis delta, que se cree que se propaga mediante un mecanismo de doble círculo rodante . ^{[ 2 ] [ 3 ]} La ribozima es activa in vivo en ausencia de factores proteicos y, en el momento de su descubrimiento, era el ARN autocortante natural más rápido conocido. ^{[ 4 ]}

La estructura cristalina de esta ribozima se ha resuelto utilizando cristalografía de rayos X y muestra cinco segmentos helicoidales conectados por un doble pseudonudo . ^{[ 1 ]}

Además de la versión genómica (con sentido), todos los virus HDV también poseen una versión antigénica de la ribozima HDV. ^{[ 5 ]} Esta versión no es la secuencia complementaria exacta, pero adopta la misma estructura que la cadena genómica (con sentido). Las únicas diferencias "significativas" entre ambas son una pequeña protuberancia en el tallo P4 y una unión J4/2 más corta. Tanto la ribozima genómica como la antigénica son necesarias para la replicación. ^{[ 2 ]}

La ribozima del VHD está relacionada estructural y bioquímicamente con muchas otras ribozimas de autocorte. Estas otras ribozimas se suelen denominar ejemplos de ribozimas del VHD debido a estas similitudes, aunque no se encuentren en los virus de la hepatitis delta. También se las puede denominar "similares al VHD" para indicar este hecho. ^{[ 6 ]}

Los ribozimas similares al HDV incluyen el ribozima CPEB3 de mamíferos , los ribozimas theta en bacteriófagos, miembros de retrotransposones (por ejemplo, en el elemento de ARN R2 en insectos y en el L1Tc y probablemente otros retrotransposones en tripanosomátidos) y secuencias de bacterias. ^{[ 7 ] [ 8 ] [ 6 ] [ 9 ] [ 10 ] [ 11 ]} La agrupación es probablemente el resultado de la evolución convergente : el deltavirus encontrado fuera de los humanos también posee un ribozima DV, y ningún escenario de transferencia horizontal de genes propuesto puede explicar esto todavía. ^{[ 12 ] [ 13 ] [ 14 ]}

La ribozima del VHD cataliza la escisión del enlace fosfodiéster entre el nucleótido u oligonucleótido sustrato y el 5′-hidroxilo de la ribozima. En el virus de la hepatitis delta, esta secuencia de nucleótidos sustrato comienza con uridina y se conoce como U(-1); sin embargo, la identidad del nucleótido -1 no cambia significativamente la velocidad de catálisis. ^{[ 1 ]} Solo se requiere su naturaleza química, ya que, como demostraron Perrotta y Been, la sustitución de la ribosa U(-1) por desoxirribosa anula la reacción, lo cual es consistente con la predicción de que el 2′-hidroxilo es el nucleófilo en la reacción química. ^{[ 15 ]} Por lo tanto, a diferencia de muchas otras ribozimas, como la ribozima cabeza de martillo , la ribozima del VHD no tiene requisitos previos para la catálisis y solo requiere un único ribonucleótido -1 como sustrato para reaccionar eficientemente. ^{[ 1 ]}

Inicialmente, se creía que el nucleótido 75 del ribozima, una citosina conocida como C75, podía actuar como una base general, con el N3 de C75 abstraiendo un protón del 2′-hidroxilo del nucleótido U(-1) para facilitar el ataque nucleofílico al enlace fosfodiéster. ^{[ 1 ]} Sin embargo, aunque está bien establecido que el N3 de C75 tiene un pKa perturbado de su valor normal de 4,45 y está más cerca de 6,15 o 6,40, ^{[ 16 ] [ 17 ]} no es lo suficientemente neutro como para actuar como un catalizador de base general. En cambio, se cree que el N3 de C75 actúa como un ácido de Lewis para estabilizar el 5′-hidroxilo saliente del ribozima; esto está respaldado por su proximidad al 5′-hidroxilo en la estructura cristalina. ^{[ 1 ] [ 18 ]} La sustitución del nucleótido C75 por cualquier otro nucleótido anula o perjudica sustancialmente la actividad de la ribozima, aunque esta actividad puede restaurarse parcialmente con imidazol , lo que implica aún más a C75 en la actividad catalítica. ^{[ 19 ]}

El C75 en la ribozima HDV ha sido objeto de varios estudios debido a su peculiar pKa. Los valores típicos de pKa para los nucleósidos libres se encuentran alrededor de 3,5 a 4,2; estos valores de pKa más bajos son ácidos y es improbable que se vuelvan básicos. Sin embargo, es probable que el entorno estructural dentro de la ribozima, que incluye una hendidura del sitio activo desolvatada , proporcione un potencial electrostático negativo que podría perturbar el pKa de la citosina lo suficiente como para actuar como un ácido de Lewis. ^{[ 20 ] [ 21 ] [ 22 ] [ 23 ]}

Además de la estabilización del grupo saliente 5′-hidroxilo por el ácido de Lewis, ahora también se acepta que la ribozima HDV puede usar un ion metálico para ayudar en la activación del 2′-hidroxilo para el ataque al nucleótido U(-1). Un ion magnesio en el sitio activo de la ribozima está coordinado al nucleófilo 2′-hidroxilo y a un oxígeno del fosfato escindible, y puede actuar como un ácido de Lewis para activar el 2′-hidroxilo. ^{[ 19 ] [ 18 ]} Además, es posible que el fosfato de U23 pueda actuar como un ácido de Lewis para aceptar un protón del 2′-hidroxilo con el magnesio actuando como un ion coordinador. ^{[ 24 ]} Debido a que la ribozima HDV no requiere iones metálicos para tener actividad, no es una metaloenzima obligada, pero la presencia de magnesio en el sitio activo mejora significativamente la reacción de escisión. La ribozima HDV parece tener un requerimiento no específico de bajas cantidades de cationes divalentes para plegarse, siendo activa en Mg ²⁺ , Ca ²⁺ , Mn ²⁺ , y Sr ²⁺ . ^{[ 1 ]} En ausencia de iones metálicos, parece probable que el agua pueda reemplazar el papel del magnesio como ácido de Lewis.

Debido a la naturaleza de autocorte rápido de la ribozima HDV, los experimentos previos con ribonucleasa se realizaron en el producto 3′ del autocorte en lugar del precursor. ^{[ 25 ]} Sin embargo, se sabe que la secuencia flanqueante participa en la regulación de la actividad de autocorte de la ribozima HDV. ^{[ 26 ] [ 27 ] [ 28 ]} Por lo tanto, la secuencia corriente arriba 5′ al sitio de autocorte se ha incorporado para estudiar la actividad de autocorte resultante de la ribozima HDV. ^{[ 26 ]} Se han identificado dos estructuras alternativas.

La primera estructura inhibitoria está plegada por un transcrito extendido (es decir, el transcrito -30/99, las coordenadas se referencian con respecto al sitio de autocorte) que abarca desde 30 nt aguas arriba del sitio de corte hasta 15 nt aguas abajo del extremo 3′. ^{[ 26 ]} La secuencia flanqueante secuestra la ribozima en una trampa cinética durante la transcripción y da como resultado una tasa de autocorte extremadamente disminuida. ^{[ 26 ]} Esta estructura que previene el autocorte incluye 3 tallos alternativos: Alt1, Alt2 y Alt3, que interrumpen la conformación activa. Alt1 es una interacción de largo alcance de 10 pb formada por un tramo inhibidor aguas arriba (-25/-15 nt) y el tramo aguas abajo (76/86 nt). ^{[ 26 ]} Alt1 interrumpe el tallo P2 en la conformación activa donde se propone que P2 tiene un papel activador tanto para la ribozima genómica como para la antigénica. ^{[ 26 ] [ 29 ] [ 30 ]} Alt2 es una interacción entre la secuencia flanqueante corriente arriba y la ribozima, y ​​Alt3 es una interacción ribozima-ribozima no nativa. ^{[ 26 ]}

La estructura secundaria de esta conformación inhibitoria está respaldada por varios enfoques experimentales. ^{[ 26 ]} Primero, se realizó un sondeo directo mediante ribonucleasas y el modelado posterior mediante mfold 3.0 utilizando restricciones de los resultados del sondeo concuerda con la estructura propuesta. ^{[ 26 ]} Segundo, se utilizó una serie de oligómeros de ADN complementarios a diferentes regiones de AS1/2 para rescatar la actividad de la ribozima; los resultados confirman las funciones inhibitorias de AS1/2. ^{[ 26 ]} Tercero, el análisis mutacional introduce mutaciones simples/dobles fuera de la ribozima para asegurar que la actividad de la ribozima observada esté directamente asociada con la estabilidad de Alt1. ^{[ 26 ]} Se encontró que la estabilidad de AS1 está inversamente relacionada con la actividad de autocorte. ^{[ 26 ]}

La segunda estructura permisiva permite que la ribozima HDV se autocorte cotranscripcionalmente y esta estructura incluye además la porción -54/-18 nt del transcrito de ARN. ^{[ 26 ]} El tramo inhibidor -24/-15 aguas arriba de la conformación inhibidora mencionada anteriormente ahora está secuestrado en una horquilla P(-1) ubicada aguas arriba del sitio de corte. ^{[ 26 ] [ 31 ] [ 32 ]} Sin embargo, el motivo P(-1) solo se encuentra en la secuencia genómica, lo que puede estar correlacionado con el fenómeno de que las copias de ARN genómico de HDV son más abundantes en las células hepáticas infectadas. ^{[ 26 ] [ 5 ]} La evidencia experimental también respalda esta estructura alternativa. Primero, se utiliza el mapeo estructural mediante ribonucleasa para analizar el fragmento -54/-1 en lugar de todo el transcrito precursor debido a la rápida escisión de esta estructura, lo que coincide con la horquilla local P(-1) (entre -54/-40 y -18/-30 nt). ^{[ 26 ]} En segundo lugar, se encuentra conservación evolutiva en P(-1) y la región de enlace entre P(-1) y P1 entre 21 aislados de ARN genómico del VHD. ^{[ 26 ]}

Las propiedades especiales de la reacción de escisión de la ribozima HDV la convierten en una herramienta útil para preparar transcritos de ARN con extremos 3′ homogéneos, una alternativa a la transcripción de ARN con la ARN polimerasa T7, que a menudo puede producir extremos heterogéneos o adiciones no deseadas. La versión de ADNc de la ribozima se puede preparar adyacente al ADNc de la secuencia de ARN diana y al ARN preparado a partir de la transcripción con la ARN polimerasa T7. La secuencia de la ribozima se escindirá eficientemente sin requisitos posteriores, ya que el nucleótido -1 es invariable, dejando un fosfato cíclico 2′–3′ que se puede eliminar fácilmente mediante tratamiento con una fosfatasa o una polinucleótido quinasa T4. ^{[ 33 ]} El ARN diana se puede purificar mediante purificación en gel.

• Página sobre la ribozima del virus de la hepatitis delta en Rfam
• Entrada de la base de datos de ARN subviral para la ribozima del VHD