Análisis de fusión de alta resolución

La temperatura de fusión del amplicón, a la cual se separan las dos hebras de ADN, es totalmente predecible. Depende de la secuencia de bases del ADN. Si se comparan dos muestras de dos personas diferentes, deberían presentar curvas de fusión con la misma forma. Sin embargo, si una persona tiene una mutación en la región de ADN amplificada, esto alterará la temperatura de fusión. Por lo tanto, las dos curvas de fusión serán diferentes. La diferencia puede ser mínima, quizás una fracción de grado, pero gracias a que el equipo HRM tiene la capacidad de monitorizar este proceso con alta resolución, es posible documentar con precisión estos cambios y, por lo tanto, identificar si existe o no una mutación.

Las cosas se complican un poco más porque los organismos contienen dos ( o más ) copias de cada gen, conocidas como los dos alelos . Por lo tanto, si se toma una muestra de un paciente y se amplifica mediante PCR, se amplifican ambas copias de la región de ADN (alelos) de interés. Así que, si buscamos una mutación, ahora tenemos tres posibilidades:

1. Ninguno de los alelos contiene una mutación.
2. Uno u otro alelo contiene una mutación.
3. Ambos alelos contienen una mutación.

Estos tres escenarios se conocen como "tipo salvaje", "heterocigoto" u "homocigoto", respectivamente. Cada uno produce una curva de fusión ligeramente diferente. Con un ensayo HRM de alta calidad, es posible distinguir entre estos tres escenarios.

Las variantes alélicas homocigotas pueden caracterizarse por un desplazamiento de temperatura en la curva de fusión resultante del análisis HRM. En comparación, los heterocigotos se caracterizan por cambios en la forma de la curva de fusión. Esto se debe a un desajuste de pares de bases generado como resultado de la hibridación heteroduplex desestabilizada entre las hebras de tipo silvestre y variante. Estas diferencias se pueden observar fácilmente en la curva de fusión resultante, y las diferencias en el perfil de fusión entre los distintos genotipos se pueden amplificar visualmente mediante la generación de una curva de diferencia ^{[ 2 ].}

Los métodos convencionales de tipificación de SNP suelen ser laboriosos y costosos, ya que requieren la multiplexación de varios ensayos basados ​​en sondas o el uso de microarrays de ADN. HRM es más rentable y reduce la necesidad de diseñar múltiples pares de cebadores y la necesidad de comprar sondas costosas. El método HRM se ha utilizado con éxito para detectar una única sustitución de G por A en el gen Vssc ( canal de sodio sensible al voltaje ), que confiere resistencia al acaricida permetrina en el ácaro de la sarna. Esta mutación produce un cambio en la codificación de la proteína (G1535D). El análisis de ácaros de la sarna recolectados de poblaciones sospechosas de ser susceptibles y tolerantes a la permetrina mediante HRM mostró perfiles de fusión distintos. Se observó que los amplicones de los ácaros sensibles tenían una temperatura de fusión más alta en relación con los ácaros tolerantes, como se esperaba de la mayor termoestabilidad del par de bases GC ^{[ 3 ].}

En un campo más relevante para el diagnóstico clínico, se ha demostrado que HRM es adecuado en principio para la detección de mutaciones en los genes de susceptibilidad al cáncer de mama BRCA1 y BRCA2 . Se han identificado más de 400 mutaciones en estos genes. La secuenciación de genes es el estándar de oro para identificar mutaciones. La secuenciación consume mucho tiempo y mano de obra y a menudo está precedida por técnicas utilizadas para identificar ADN heteroduplex, lo que luego amplifica aún más estos problemas. HRM ofrece un método de tubo cerrado más rápido y conveniente para evaluar la presencia de mutaciones y proporciona un resultado que puede investigarse más a fondo si es de interés. En un estudio realizado por Scott et al. en 2006, ^{[ 4 ]} se utilizaron 3 líneas celulares que albergaban diferentes mutaciones BRCA para evaluar la metodología HRM. Se encontró que los perfiles de fusión de los productos de PCR resultantes podían usarse para distinguir la presencia o ausencia de una mutación en el amplicón. De manera similar en 2007 Krypuy et al. ^{[ 5 ]} demostraron que el diseño cuidadoso de los ensayos HRM (en cuanto a la colocación de los cebadores) podría emplearse con éxito para detectar mutaciones en el gen TP53, que codifica la proteína supresora de tumores p53 en muestras clínicas de cáncer de mama y ovario . Ambos estudios destacaron que los cambios en el perfil de fusión pueden ser en forma de un desplazamiento en la temperatura de fusión o una diferencia evidente en la forma de la curva de fusión. Ambos parámetros son función de la secuencia del amplicón. Existe consenso en que HRM es un método rentable que puede emplearse como cribado inicial para muestras sospechosas de albergar polimorfismos o mutaciones. Esto reduciría el número de muestras que necesitan ser investigadas más a fondo utilizando métodos más convencionales.

Actualmente existen muchos métodos utilizados para determinar el estado de cigocidad de un gen en un locus particular. Estos métodos incluyen el uso de PCR con sondas diseñadas específicamente para detectar las variantes de los genes (la tipificación de SNP es el caso más simple). En los casos en que se implican segmentos más largos de variación, puede ser necesario el análisis posterior a la PCR de los amplicones. Se pueden medir los cambios en la restricción enzimática, los perfiles electroforéticos y cromatográficos. Estos métodos suelen ser más laboriosos y aumentan el riesgo de contaminación de amplicones en el laboratorio, debido a la necesidad de trabajar con altas concentraciones de amplicones en el laboratorio después de la PCR. El uso de HRM reduce el tiempo requerido para el análisis y el riesgo de contaminación. HRM es una solución más rentable y el elemento de alta resolución no solo permite la determinación de homocigosidad y heterocigosidad , sino que también resuelve información sobre el tipo de homocigosidad y heterocigosidad, ya que diferentes variantes genéticas dan lugar a diferentes formas de curvas de fusión. Un estudio de Gundry et al. En 2003, ^{[ 6 ]} se demostró que el marcaje fluorescente de un cebador (en el par) era más favorable que el uso de un colorante intercalante como SYBR Green I. Sin embargo, se han logrado avances en el desarrollo y uso de colorantes intercalantes mejorados ^{[ 7 ]} que reducen el problema de la inhibición de la PCR y las preocupaciones sobre la intercalación no saturante del colorante.

La metodología HRM también se ha utilizado para proporcionar un análisis fiable del estado de metilación del ADN. Esto es significativo, ya que los cambios en el estado de metilación de los genes supresores de tumores, genes que regulan la apoptosis y la reparación del ADN , son característicos del cáncer y también tienen implicaciones para la respuesta a la quimioterapia. Por ejemplo, los pacientes con cáncer pueden ser más sensibles al tratamiento con agentes alquilantes del ADN si el promotor del gen de reparación del ADN MGMT del paciente está metilado. En un estudio que analizó el estado de metilación del promotor de MGMT en 19 muestras colorrectales, se encontró que 8 muestras estaban metiladas. ^{[ 8 ]} Otro estudio comparó el poder predictivo de la metilación del promotor de MGMT en 83 pacientes con glioma de alto grado obtenido mediante MSP , pirosecuenciación y HRM. Se encontró que el método HRM era al menos equivalente a la pirosecuenciación en la cuantificación del nivel de metilación. ^{[ 9 ]}

El ADN metilado puede tratarse mediante modificación con bisulfito, que convierte las citosinas no metiladas en uracilo . Por lo tanto, los productos de PCR resultantes de una plantilla originalmente no metilada tendrán un punto de fusión más bajo que los derivados de una plantilla metilada. La técnica HRM también permite determinar la proporción de metilación en una muestra determinada, comparándola con una curva estándar generada mediante la mezcla de diferentes proporciones de ADN metilado y no metilado. Esto puede proporcionar información sobre el grado de metilación de un tumor y, por consiguiente, indicar sus características y su grado de desviación de lo considerado "normal".

La técnica HRM también resulta ventajosa en la práctica para su uso en diagnósticos, debido a su capacidad de adaptarse a pruebas de cribado de alto rendimiento, y, además, minimiza la posibilidad de propagación de amplicones y contaminación dentro de un laboratorio, gracias a su formato de tubo cerrado.

Para seguir la transición de dsDNA (ADN de doble cadena) a ssDNA (ADN de cadena simple), se emplean colorantes intercalantes. Estos colorantes muestran una emisión de fluorescencia diferencial que depende de su asociación con ADN de doble o cadena simple. SYBR Green I es un colorante de primera generación para HRM. Fluoresce cuando se intercala en dsDNA y no en ssDNA. Debido a que puede inhibir la PCR en altas concentraciones, se utiliza en concentraciones subsaturantes. Recientemente, algunos investigadores han desaconsejado el uso de SYBR Green I para HRM, ^{[ 10 ]} afirmando que se requieren modificaciones sustanciales del protocolo. Esto se debe a que se sugiere que la falta de precisión puede resultar del "salto del colorante", donde el colorante de un dúplex desnaturalizado puede reincorporarse en regiones de dsDNA que aún no se han desnaturalizado. ^{[ 6 ] [ 10 ]} En el mercado se encuentran disponibles nuevos colorantes saturantes como LC Green y LC Green Plus, ResoLight, EvaGreen, Chromofy y SYTO 9, que se han utilizado con éxito para HRM. Sin embargo, algunos grupos han utilizado con éxito SYBR Green I para HRM con los instrumentos Corbett Rotorgene ^{[ 11 ]} y recomiendan el uso de SYBR Green I para aplicaciones de HRM.