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Articulo de referencia

Análisis de la curva de fusión

El análisis de la curva de fusión evalúa las características de disociación del ADN de doble cadena durante el calentamiento. Al aumentar la temperatura, la doble cadena comienz...

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El análisis de la curva de fusión evalúa las características de disociación del ADN de doble cadena durante el calentamiento. Al aumentar la temperatura, la doble cadena comienza a disociarse, lo que provoca un incremento en la intensidad de la absorbancia ( hipercromicidad ). La temperatura a la que se desnaturaliza el 50 % del ADN se conoce como temperatura de fusión . La medición de la temperatura de fusión puede ayudarnos a predecir la especie con solo estudiarla, ya que cada organismo posee una curva de fusión específica.

Una mayor proporción de pares de bases GC (en comparación con los pares de bases AT) conlleva un punto de fusión más elevado. Esto se debe a las energías de apilamiento más favorables asociadas a los dímeros que contienen pares de bases GC.

La información también proporciona pistas vitales sobre el modo de interacción de una molécula con el ADN. Moléculas como los intercaladores se insertan entre los pares de bases e interactúan mediante apilamiento pi . Esto estabiliza la estructura del ADN, lo que provoca un aumento en su temperatura de fusión. Del mismo modo, el aumento de la concentración de sal ayuda a disipar las repulsiones negativas entre los fosfatos de la cadena principal del ADN. Esto también eleva la temperatura de fusión del ADN. Por el contrario, el pH puede tener un efecto negativo en la estabilidad del ADN, lo que puede provocar una disminución de su temperatura de fusión.

Implementación

Gráficos que muestran la relación entre la fluorescencia y la temperatura para sondas marcadas diseñadas para secuencias Wt, homocigotas Wt, heterocigotas y homocigotas mutantes.

La energía necesaria para romper los enlaces de hidrógeno entre las bases de dos hebras de ADN depende de su longitud, su contenido de GC y su complementariedad. Calentando una mezcla de reacción que contiene secuencias de ADN de doble cadena y midiendo la disociación en función de la temperatura, se pueden inferir estas características.

Originalmente, la disociación de la hebra se observó utilizando mediciones de absorbancia UV, [ 1 ] pero las técnicas basadas en mediciones de fluorescencia [ 2 ] son ​​ahora el enfoque más común.

La disociación dependiente de la temperatura entre dos hebras de ADN puede medirse utilizando un fluoróforo intercalante de ADN como SYBR Green , EvaGreen o sondas de ADN marcadas con fluoróforos . En el caso de SYBR Green (que fluoresce 1000 veces más intensamente cuando se intercala en el surco menor de dos hebras de ADN), la disociación del ADN durante el calentamiento se puede medir por la gran reducción de la fluorescencia resultante. [ 3 ] Alternativamente, se pueden utilizar sondas yuxtapuestas (una con un fluoróforo y la otra con un extintor adecuado ) para determinar la complementariedad de la sonda con la secuencia diana. [ 3 ]

La gráfica de la primera derivada negativa de la curva de fusión puede facilitar la determinación de la temperatura de disociación (definida como el 50% de disociación), gracias a los picos que se forman en ella.

En 1997, SYBR Green permitió la diferenciación de productos en el LightCycler. [ 4 ] También se demostró que las sondas de hibridación (o sondas FRET) proporcionaban curvas de fusión muy específicas a partir del híbrido sonda-amplicón de cadena simple (ss). Idaho Technology y Roche han contribuido significativamente a popularizar este uso en el instrumento LightCycler.

Aplicaciones

Desde finales de la década de 1990, el análisis de productos mediante SYBR Green, otros colorantes específicos de doble cadena o el análisis de curvas de fusión basado en sondas se ha vuelto prácticamente omnipresente. La técnica basada en sondas es lo suficientemente sensible como para detectar polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) y puede distinguir entre alelos homocigotos de tipo silvestre , heterocigotos y homocigotos mutantes gracias a los patrones de disociación producidos. Sin sondas, la fusión de amplicones (fusión y análisis de todo el producto de PCR) no solía ser eficaz para encontrar variantes de una sola base mediante perfiles de fusión. Con instrumentos de mayor resolución y colorantes avanzados, el análisis de fusión de amplicones de variantes de una sola base ahora es posible con varios instrumentos disponibles comercialmente. Por ejemplo: el sistema Applied Biosystems 7500 Fast y el sistema de PCR en tiempo real 7900HT Fast, el LightScanner de Idaho Technology (el primer dispositivo de fusión de alta resolución basado en placas), los instrumentos Rotor-Gene de Qiagen y los instrumentos LightCycler 480 de Roche.

En la literatura existen numerosos ejemplos clínicos y de investigación [ 5 ] que demuestran el uso del análisis de curvas de fusión para obviar o complementar los esfuerzos de secuenciación y, por lo tanto, reducir los costos.

Aunque la mayoría de los termocicladores de PCR cuantitativa ofrecen la opción de generar y analizar curvas de fusión, el nivel de análisis y el soporte de software varían. La técnica de fusión de alta resolución (conocida como Hi-Res Melting o HRM) representa un avance de esta tecnología y ha comenzado a ofrecer mayor sensibilidad para la detección de SNP dentro de un amplicón teñido. El desarrollo de sistemas de curvas de fusión sin sondas es menos costoso y de diseño más sencillo. Sin embargo, para aplicaciones de genotipado, donde se deben procesar grandes volúmenes de muestras, el costo de desarrollo puede ser menos importante que el rendimiento total y la facilidad de interpretación, lo que favorece los métodos de genotipado basados ​​en sondas.

La fusión digital de alta resolución (dHRM) [ 6 ] también se utiliza junto con la PCR digital (dPCR) para mejorar la capacidad cuantitativa al proporcionar información adicional sobre el comportamiento de fusión del ADN amplificado, lo que puede ayudar a distinguir entre diferentes variantes genéticas y a garantizar la precisión de la cuantificación. [ 7 ] La ​​dHRM se posibilita mediante el uso de colorantes sensibles que se unen al ADN e instrumentación de PCR digital , lo que permite la recopilación de puntos de datos de alta densidad para generar perfiles de fusión detallados. Estos perfiles pueden utilizarse para identificar incluso diferencias sutiles en las secuencias de ácidos nucleicos, lo que convierte a la dHRM en una herramienta poderosa para el genotipado, el escaneo de mutaciones y el análisis de metilación. [ 8 ]

dHRM es una técnica molecular avanzada que se utiliza para el análisis de variaciones genéticas, como polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), mutaciones y metilaciones, mediante el seguimiento del comportamiento de fusión del ADN de doble cadena. [ 9 ] Es un método posterior a la PCR que implica el calentamiento gradual del ADN amplificado por PCR en presencia de colorantes intercalantes que fluorescen al unirse al ADN de doble cadena. A medida que el ADN se desnaturaliza, la fluorescencia disminuye, y los cambios en la fluorescencia se monitorizan en tiempo real con un sistema de PCR digital. Las curvas de fusión resultantes se analizan para detectar diferencias genéticas basadas en las temperaturas de fusión de los fragmentos de ADN.

La técnica se ha perfeccionado aún más mediante su aplicación en plataformas de microfluídica digital , que facilitan el análisis de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) con alta precisión y sensibilidad. [ 10 ] Además, se ha desarrollado la dHRM masivamente paralela para permitir la elaboración de perfiles de secuencia rápidos y absolutamente cuantitativos, lo que resulta especialmente útil en entornos clínicos e industriales donde la cuantificación precisa de ácidos nucleicos es fundamental. [ 11 ]

Véase también

Referencias

  1. ↑ Ansevin, AT; Vizard, DL; Brown, BW; McConathy, J. (1976), "Desnaturalización térmica de alta resolución del ADN. I. Consideraciones teóricas y prácticas para la resolución de subtransiciones térmicas", Biopolymers , 15 (1): 153–74 , doi : 10.1002/bip.1976.360150111 , PMID 1244898 
  2. ↑ Ririe, KM; Rasmussen, RP; Wittwer, CT (1997), "Diferenciación de productos mediante el análisis de curvas de fusión del ADN durante la reacción en cadena de la polimerasa", Anal. Biochem. , 245 (2): 154– 60, doi : 10.1006/abio.1996.9916 , PMID 9056205 
  3. 1 2 Hou, Shaw (2010). Biocatálisis e ingeniería biomolecular . John Wiley & Sons. págs. 314–317 . 
  4. ↑ Ririe, 1997
  5. ↑ Lay MJ, Wittwer CT. (1997) Genotipado por fluorescencia en tiempo real del factor V Leiden durante la PCR de ciclo rápido. Clin Chem. 1997 dic;43(12):2262-7
  6. ↑ Fraley, Stephanie I.; Hardick, Justin; Jo Masek, Billie; Athamanolap, Pornpat; Rothman, Richard E.; Gaydos, Charlotte A.; Carroll, Karen C.; Wakefield, Teresa; Wang, Tza-Huei; Yang, Samuel (2013). " Fluido digital universal de alta resolución: un enfoque novedoso para el perfilado de base amplia de muestras biológicas heterogéneas" . Nucleic Acids Research . 41 (18): e175. doi : 10.1093/nar/gkt684 . PMC 3794612. PMID 23935121 .  
  7. ↑ Aralar, April; Yuan, Yixu; Chen, Kevin; Geng, Yunshu; Ortiz Velez, Daniel; Sinha, Mridu; Lawrence, Shelley M.; Fraley, Stephanie I. (2020-05-26). "Mejora del poder cuantitativo en PCR digital mediante fusión digital de alta resolución" . Journal of Clinical Microbiology . 58 (6): e00325–20. doi : 10.1128/JCM.00325-20 . ISSN 1098-660X . PMC 7269394. PMID 32295887 .   
  8. ↑ "¿Qué es la fusión de alta resolución (HRM)? | Bio-Rad" . www.bio-rad.com (en coreano) . Consultado el 15 de febrero de 2024 .
  9. ↑ "Introducción a la fusión de alta resolución (también conocida como HRM, HRMA, análisis de curvas de fusión)" . dna-utah.org . Consultado el 15 de febrero de 2024 .
  10. ↑ Li, Mingzhong; Wan, Liang; Law, Man-Kay; Meng, Li; Jia, Yanwei; Mak, Pui-In; Martins, Rui P. (2022-02-01). "Análisis de curvas de fusión de alta resolución en una sola toma para la discriminación de mutaciones puntuales de KRAS en una plataforma de microfluídica digital" . Lab on a Chip . 22 (3): 537– 549. doi : 10.1039/D1LC00564B . ISSN 1473-0189 . PMID 34904611 .  
  11. ↑ Velez, Daniel Ortiz; Mack, Hannah; Jupe, Julietta; Hawker, Sinead; Kulkarni, Ninad; Hedayatnia, Behnam; Zhang, Yang; Lawrence, Shelley; Fraley, Stephanie I. (2017-02-08). "Fluido digital de alta resolución masivamente paralelo para perfilado de secuencias rápido y absolutamente cuantitativo" . Scientific Reports . 7 (1) 42326. Bibcode : 2017NatSR...742326V . doi : 10.1038/srep42326 . ISSN 2045-2322 . PMC 5296755. PMID 28176860 .   
  12. ↑ Wienken CJ, Baaske P, Duhr S, Braun D (2011), "Las curvas de fusión termoforética cuantifican la conformación y estabilidad del ARN y el ADN", Nucleic Acids Research , 39 (8): e52, doi : 10.1093/nar/gkr035 , PMC 3082908 , PMID 21297115 .  
  • Ririe, KM; Rasmussen, RP; Wittwer, CT (1997). "Diferenciación de productos mediante el análisis de curvas de fusión de ADN durante la reacción en cadena de la polimerasa". Anal Biochem . 245 (2): 154– 160. doi : 10.1006/abio.1996.9916 . PMID 9056205 . 
  • Lo, Patcick CH (2014-10-21). "Los momentos: análisis de la curva de fusión" . BioTechniques . Recuperado el 21 de octubre de 2014 .