Análisis de fusión de alta resolución

El análisis de fusión de alta resolución ( HRM ) es una técnica poderosa en biología molecular para la detección de mutaciones , polimorfismos y diferencias epigenéticas en muestras de ADN bicatenario . Fue descubierto y desarrollado por Idaho Technology y la Universidad de Utah. ^[1] Tiene ventajas sobre otras tecnologías de genotipado , a saber:

• Es rentable en comparación con otras tecnologías de genotipado , como la secuenciación y la tipificación de SNP TaqMan , lo que la hace ideal para proyectos de genotipado a gran escala.
• Es rápido y potente, por lo que puede genotipar con precisión muchas muestras rápidamente.
• Es simple. Con un ensayo HRM de buena calidad, es posible realizar una genotipificación eficaz sin necesidad de ser un genetista en cualquier laboratorio con acceso a una máquina de PCR en tiempo real con capacidad para realizar HRM.

El análisis HRM se realiza en muestras de ADN de doble cadena. Normalmente, el usuario utilizará la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) antes del análisis HRM para amplificar la región de ADN en la que se encuentra la mutación de interés. En el tubo de muestra hay ahora muchas copias de la región de ADN de interés. Esta región que se amplifica se conoce como amplicón. Después del proceso de PCR comienza el análisis HRM. El proceso es simplemente un calentamiento preciso del ADN del amplicón desde alrededor de 50 ˚C hasta alrededor de 95 ˚C. En algún momento durante este proceso, se alcanza la temperatura de fusión del amplicón y las dos cadenas de ADN se separan o "se funden".

La clave de la HRM es controlar esta separación de las hebras en tiempo real. Esto se consigue utilizando un colorante fluorescente. Los colorantes que se utilizan para la HRM se conocen como colorantes intercalantes y tienen una propiedad única. Se unen específicamente al ADN de doble cadena y, cuando se unen, emiten una fluorescencia intensa. En ausencia de ADN de doble cadena, no tienen nada a lo que unirse y solo emiten una fluorescencia de bajo nivel. Al principio del análisis de HRM hay un alto nivel de fluorescencia en la muestra debido a los miles de millones de copias del amplicón. Pero a medida que la muestra se calienta y las dos hebras del ADN se separan, la presencia de ADN de doble cadena disminuye y, por lo tanto, se reduce la fluorescencia. La máquina HRM tiene una cámara que observa este proceso midiendo la fluorescencia. Luego, la máquina simplemente traza estos datos como un gráfico conocido como curva de fusión, que muestra el nivel de fluorescencia en función de la temperatura:

La temperatura de fusión del amplicón a la que se separan las dos cadenas de ADN es totalmente predecible. Depende de la secuencia de bases del ADN. Si se comparan dos muestras de dos personas diferentes, deberían dar exactamente la misma forma de curva de fusión. Sin embargo, si una persona tiene una mutación en la región de ADN que se ha amplificado, esto alterará la temperatura a la que se separan las cadenas de ADN. Por lo tanto, ahora las dos curvas de fusión parecen diferentes. La diferencia puede ser solo minúscula, tal vez una fracción de grado, pero debido a que la máquina HRM tiene la capacidad de monitorear este proceso en "alta resolución", es posible documentar con precisión estos cambios y, por lo tanto, identificar si hay una mutación o no.

Las cosas se complican un poco más porque los organismos contienen dos ( o más ) copias de cada gen, conocidas como los dos alelos . Por lo tanto, si se toma una muestra de un paciente y se amplifica mediante PCR, se amplifican ambas copias de la región de ADN (alelos) de interés. Por lo tanto, si buscamos una mutación, ahora hay tres posibilidades:

1. Ningún alelo contiene una mutación
2. Uno u otro alelo contiene una mutación
3. Ambos alelos contienen una mutación.

Estos tres escenarios se conocen como "tipo salvaje", "heterocigoto" u "homocigoto", respectivamente. Cada uno de ellos presenta una curva de fusión ligeramente diferente. Con un ensayo HRM de alta calidad es posible distinguir entre estos tres escenarios.

Las variantes alélicas homocigóticas pueden caracterizarse por un cambio de temperatura en la curva de fusión resultante producida por el análisis HRM. En comparación, los heterocigotos se caracterizan por cambios en la forma de la curva de fusión. Esto se debe a la falta de coincidencia de pares de bases generada como resultado de la hibridación heterodúplex desestabilizada entre las cadenas de tipo salvaje y variante. Estas diferencias se pueden ver fácilmente en la curva de fusión resultante y las diferencias del perfil de fusión entre los diferentes genotipos se pueden amplificar visualmente mediante la generación de una curva de diferencia ^[2].

Los métodos convencionales de tipificación de SNP suelen ser costosos y requerir mucho tiempo, ya que requieren que se combinen varios ensayos basados ​​en sondas o que se utilicen microarreglos de ADN. El método HRM es más rentable y reduce la necesidad de diseñar múltiples pares de cebadores y de comprar sondas costosas. El método HRM se ha utilizado con éxito para detectar una única sustitución de G por A en el gen Vssc (canal de sodio sensible al voltaje) que confiere resistencia al acaricida permetrina en el ácaro de la sarna. Esta mutación da como resultado un cambio de codificación en la proteína (G1535D). El análisis de los ácaros de la sarna recolectados de poblaciones sospechosas de ser susceptibles y tolerantes a la permetrina mediante HRM mostró perfiles de fusión distintos. Se observó que los amplicones de los ácaros sensibles tenían una temperatura de fusión más alta en relación con los ácaros tolerantes, como se esperaba a partir de la mayor termoestabilidad del par de bases GC ^[3].

En un campo más relevante para el diagnóstico clínico, se ha demostrado que la HRM es adecuada en principio para la detección de mutaciones en los genes de susceptibilidad al cáncer de mama BRCA1 y BRCA2. Se han identificado más de 400 mutaciones en estos genes.
La secuenciación de genes es el estándar de oro para identificar mutaciones. La secuenciación requiere mucho tiempo y trabajo y a menudo está precedida por técnicas utilizadas para identificar ADN heterodúplex, que luego amplifican aún más estos problemas. La HRM ofrece un método de tubo cerrado más rápido y conveniente para evaluar la presencia de mutaciones y proporciona un resultado que puede investigarse más a fondo si es de interés. En un estudio realizado por Scott et al. en 2006, ^[4] se utilizaron 3 líneas celulares que albergaban diferentes mutaciones BRCA para evaluar la metodología HRM. Se descubrió que los perfiles de fusión de los productos de PCR resultantes podrían usarse para distinguir la presencia o ausencia de una mutación en el amplicón. De manera similar, en 2007 Krypuy et al. ^[5] demostró que el diseño cuidadoso de los ensayos de HRM (con respecto a la colocación de los cebadores) podría emplearse con éxito para detectar mutaciones en el gen TP53, que codifica la proteína supresora de tumores p53 en muestras clínicas de cáncer de mama y ovario. Ambos estudios destacaron el hecho de que los cambios en el perfil de fusión pueden presentarse en forma de un cambio en la temperatura de fusión o una diferencia obvia en la forma de la curva de fusión. Ambos parámetros son una función de la secuencia del amplicón. El consenso es que HRM es un método rentable que puede emplearse como una prueba inicial para muestras sospechosas de albergar polimorfismos o mutaciones. Esto reduciría la cantidad de muestras que necesitan investigarse más a fondo utilizando métodos más convencionales.

En la actualidad, existen muchos métodos que se utilizan para determinar el estado de cigosidad de un gen en un locus particular. Estos métodos incluyen el uso de PCR con sondas diseñadas específicamente para detectar las variantes de los genes (la tipificación de SNP es el caso más simple). En los casos en los que están implicados tramos más largos de variación, puede ser necesario un análisis posterior a la PCR de los amplicones. Se pueden medir los cambios en la restricción enzimática, los perfiles electroforéticos y cromatográficos. Estos métodos suelen requerir más tiempo y aumentan el riesgo de contaminación de amplicones en el laboratorio, debido a la necesidad de trabajar con altas concentraciones de amplicones en el laboratorio después de la PCR. El uso de HRM reduce el tiempo necesario para el análisis y el riesgo de contaminación. HRM es una solución más rentable y el elemento de alta resolución no solo permite la determinación de homo y heterocigosidad , sino que también resuelve información sobre el tipo de homo y heterocigosidad, con diferentes variantes genéticas que dan lugar a diferentes formas de curva de fusión. Un estudio de Gundry et al. 2003, ^[6] demostró que el marcado fluorescente de un cebador (en el par) ha demostrado ser favorable sobre el uso de un colorante intercalante como SYBR green I. Sin embargo, se han logrado avances en el desarrollo y uso de colorantes intercalantes mejorados ^[7] que reducen el problema de la inhibición de PCR y las preocupaciones sobre la intercalación no saturada del colorante.

La metodología HRM también se ha utilizado para proporcionar un análisis fiable del estado de metilación del ADN. Esto es importante porque los cambios en el estado de metilación de los genes supresores de tumores, genes que regulan la apoptosis y la reparación del ADN, son características de los cánceres y también tienen implicaciones para las respuestas a la quimioterapia. Por ejemplo, los pacientes con cáncer pueden ser más sensibles al tratamiento con agentes alquilantes del ADN si el promotor del gen de reparación del ADN MGMT del paciente está metilado. En un estudio que probó el estado de metilación del promotor MGMT en 19 muestras colorrectales, se encontró que 8 muestras estaban metiladas. ^[8] Otro estudio comparó el poder predictivo de la metilación del promotor MGMT en 83 pacientes con glioma de alto grado obtenidos por MSP , pirosecuenciación y HRM. Se encontró que el método HRM era al menos equivalente a la pirosecuenciación en la cuantificación del nivel de metilación. ^[9]

El ADN metilado se puede tratar mediante modificación con bisulfito, que convierte las citosinas no metiladas en uracilo . Por lo tanto, los productos de PCR resultantes de una plantilla que originalmente no estaba metilada tendrán un punto de fusión más bajo que los derivados de una plantilla metilada. La HRM también ofrece la posibilidad de determinar la proporción de metilación en una muestra dada, comparándola con una curva estándar que se genera mezclando diferentes proporciones de ADN metilado y no metilado. Esto puede ofrecer información sobre el grado de metilación que puede tener un tumor y, por lo tanto, dar una indicación del carácter del tumor y de cuánto se desvía de lo que es "normal".

La HRM también es prácticamente ventajosa para su uso en diagnóstico, debido a su capacidad de adaptarse a pruebas de detección de alto rendimiento, y nuevamente minimiza la posibilidad de propagación y contaminación de amplicones dentro de un laboratorio, debido a su formato de tubo cerrado.

Para seguir la transición de dsADN (bicatenario) a ssADN (monocatenario), se emplean colorantes intercalantes. Estos colorantes muestran una emisión de fluorescencia diferencial que depende de su asociación con ADN bicatenario o monocatenario. SYBR Green I es un colorante de primera generación para HRM. Fluoresce cuando se intercala en dsADN y no en ssADN. Debido a que puede inhibir la PCR en altas concentraciones, se utiliza en concentraciones subsaturadas. Recientemente, algunos investigadores han desaconsejado el uso de SYBR Green I para HRM, ^[10] alegando que se requieren modificaciones sustanciales del protocolo. Esto se debe a que se sugiere que la falta de precisión puede ser resultado de "saltos de colorante", donde el colorante de un dúplex fundido puede reincorporarse a regiones de dsADN que aún no se habían fundido. ^{[6] [10]} En el mercado se encuentran disponibles nuevos colorantes saturados como LC Green y LC Green Plus, ResoLight, EvaGreen, Chromofy y SYTO 9 que se han utilizado con éxito para la HRM. Sin embargo, algunos grupos han utilizado con éxito SYBR Green I para la HRM con los instrumentos Corbett Rotorgene ^[11] y abogan por el uso de SYBR Green I para aplicaciones de HRM.

Los ensayos de fusión de alta resolución generalmente implican la amplificación por qPCR seguida de una curva de fusión obtenida con un colorante fluorescente. Debido a la sensibilidad del análisis de fusión de alta resolución, es necesario considerar cuidadosamente las condiciones del ciclo de PCR, la calidad del ADN molde y los parámetros de la curva de fusión. ^[12] Para obtener resultados precisos y repetibles, las condiciones del ciclo térmico de PCR deben optimizarse para garantizar que la región de ADN deseada se amplifique con alta especificidad y sesgo mínimo entre las variantes de secuencia. La curva de fusión generalmente se realiza en un amplio rango de temperaturas en incrementos pequeños (~0,3 °C) que son lo suficientemente largos (~10 segundos) para que el ADN alcance el equilibrio en cada paso de temperatura.

Además de las consideraciones típicas del diseño de cebadores , el diseño de cebadores para ensayos de fusión de alta resolución implica maximizar las diferencias termodinámicas entre los productos de PCR que pertenecen a diferentes genotipos. Los amplicones más pequeños generalmente producen una mayor variación de la temperatura de fusión que los amplicones más largos, pero la variabilidad no se puede predecir a simple vista. Por este motivo, es fundamental predecir con precisión la curva de fusión de los productos de PCR al diseñar cebadores que distinguirán las variantes de secuencia. Hay disponible software especializado, como uMelt ^[13] y DesignSignatures ^[14] , para ayudar a diseñar cebadores que maximizarán la variabilidad de la curva de fusión específicamente para ensayos de fusión de alta resolución.

• Análisis de la curva de fusión

• Tecnología de gestión de recursos humanos