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Tecnología de hibridoma

Representación general del método de hibridoma utilizado para producir anticuerpos monoclonales. La tecnología de hibridomas es un método para producir grandes cantidades de ant...

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Representación general del método de hibridoma utilizado para producir anticuerpos monoclonales.

La tecnología de hibridomas es un método para producir grandes cantidades de anticuerpos monoclonales mediante la fusión de linfocitos B productores de anticuerpos con células de mieloma (linfocitos B cancerosos). Esto crea células híbridas, o hibridomas, que producen el anticuerpo a partir de su linfocito B progenitor, manteniendo las propiedades de la línea celular de mieloma original: inmortalidad (reproducción continua) y características deseables para el cultivo celular . Los linfocitos B que se utilizan generalmente se obtienen de animales inmunizados con un antígeno contra el cual se desea obtener un anticuerpo.

Tras la formación de los hibridomas, se eliminan las células no híbridas antes del cribado y la monoclonalización para crear líneas de hibridomas derivadas de una célula parental, que producen así el mismo anticuerpo contra el objetivo deseado.

La producción de anticuerpos monoclonales fue inventada por César Milstein y Georges JF Köhler en 1975. Compartieron el Premio Nobel de Medicina y Fisiología de 1984 con Niels Kaj Jerne , quien realizó otras contribuciones a la inmunología. El término hibridoma fue acuñado por Leonard Herzenberg durante su año sabático en el laboratorio de Milstein entre 1976 y 1977. [ 1 ]

Método

(1) Inmunización de un ratón (2) Aislamiento de células B del bazo (3) Cultivo de células de mieloma (4) Fusión de células de mieloma y células B (5) Separación de líneas celulares (6) Selección de líneas celulares adecuadas (7) Multiplicación in vitro (a) o in vivo (b) (8) Procesamiento del bazo extirpado para la extracción de anticuerpos
Células de hibridoma cultivadas en cultivo de tejidos. La imagen muestra un único clon de células, cada una de las cuales produce grandes cantidades de un anticuerpo monoclonal específico que secretan y que puede purificarse fácilmente del medio de cultivo.

Los animales de laboratorio ( mamíferos , por ejemplo, ratones) se exponen primero al antígeno contra el cual se generará un anticuerpo. Generalmente, esto se realiza mediante una serie de inyecciones del antígeno en cuestión, a lo largo de varias semanas. Estas inyecciones suelen ir seguidas de la electroporación in vivo , que potencia significativamente la respuesta inmunitaria. Una vez aislados los esplenocitos del bazo del mamífero , las células B se fusionan con células de mieloma inmortalizadas. La fusión de las células B con las células de mieloma puede realizarse mediante electrofusión. La electrofusión provoca que las células B y las células de mieloma se alineen y se fusionen mediante la aplicación de un campo eléctrico. Alternativamente, la fusión de las células B y las células de mieloma puede inducirse mediante protocolos químicos, generalmente utilizando polietilenglicol . Las células de mieloma se seleccionan previamente para asegurar que no secreten anticuerpos y que carezcan del gen de la hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (HGPRT), lo que las hace sensibles (o vulnerables) al medio HAT (véase más adelante).

Las células fusionadas se incuban en medio HAT ( medio de hipoxantina , aminopterina y timidina ) durante aproximadamente 10 a 14 días. La aminopterina bloquea la vía que permite la síntesis de nucleótidos. Por lo tanto, las células de mieloma no fusionadas mueren, ya que no pueden producir nucleótidos por las vías de novo o de rescate debido a la falta de HGPRT. La eliminación de las células de mieloma no fusionadas es necesaria porque tienen el potencial de proliferar más que otras células, especialmente los hibridomas débilmente establecidos. Las células B no fusionadas mueren debido a su corta vida útil. De esta manera, solo sobreviven los híbridos de células B y mieloma, ya que el gen HGPRT proveniente de las células B es funcional. Estas células producen anticuerpos (una propiedad de las células B) y son inmortales (una propiedad de las células de mieloma). El medio de incubación se diluye en placas de múltiples pocillos de tal manera que cada pocillo contiene solo una célula. Dado que los anticuerpos en un pocillo son producidos por la misma célula B, estarán dirigidos al mismo epítopo y, por lo tanto, son anticuerpos monoclonales.

La siguiente etapa es un proceso de cribado primario rápido, que identifica y selecciona solo aquellos hibridomas que producen anticuerpos de especificidad apropiada. La primera técnica de cribado utilizada se llama ELISA . El sobrenadante del cultivo de hibridoma, el conjugado marcado con enzima secundaria y el sustrato cromogénico se incuban, y la formación de un producto coloreado indica un hibridoma positivo. Alternativamente, inmunocitoquímica, [ 2 ] western blot e inmunoprecipitación-espectrometría de masas. A diferencia de los ensayos de western blot, la inmunoprecipitación-espectrometría de masas facilita el cribado y la clasificación de clones que se unen a las formas nativas (no desnaturalizadas) de las proteínas antigénicas. [ 3 ] El cribado por citometría de flujo se ha utilizado para el cribado primario de un gran número (~1000) de clones de hibridoma que reconocen la forma nativa del antígeno en la superficie celular. [ 4 ] En el cribado basado en citometría de flujo, se utiliza una mezcla de células antígeno-negativas y células antígeno-positivas como antígeno a analizar para cada muestra de sobrenadante de hibridoma. [ 4 ]

La célula B que produce los anticuerpos deseados puede clonarse para generar muchos clones hijos idénticos. Los medios suplementarios que contienen interleucina-6 (como briclone ) son esenciales para este paso. Una vez establecida una colonia de hibridoma, esta crecerá continuamente en un medio de cultivo como RPMI-1640 (con antibióticos y suero fetal bovino) y producirá anticuerpos. [ 2 ]

Inicialmente, se utilizan placas de múltiples pocillos para el cultivo de hibridomas, y tras la selección, se cambian a matraces de cultivo de tejidos más grandes. Esto mantiene la viabilidad de los hibridomas y proporciona suficientes células para la criopreservación y sobrenadante para investigaciones posteriores. El sobrenadante de cultivo puede producir de 1 a 60  μg/ml de anticuerpo monoclonal, que se conserva a -20  °C o menos hasta su uso. [ 2 ]

Mediante el uso del sobrenadante del cultivo o una preparación de inmunoglobulina purificada, se puede realizar un análisis adicional de un hibridoma productor de anticuerpos monoclonales potenciales en términos de reactividad, especificidad y reactividad cruzada. [ 2 ]

Aplicaciones

El uso de anticuerpos monoclonales es muy amplio e incluye la prevención, el diagnóstico y el tratamiento de enfermedades. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden distinguir subconjuntos de linfocitos B y T , lo que resulta útil para identificar diferentes tipos de leucemia . Además, se han utilizado anticuerpos monoclonales específicos para definir marcadores de superficie celular en leucocitos y otros tipos celulares. Esto dio lugar a la serie de marcadores CD (Cluster of Differentiation Series), conocidos comúnmente como marcadores CD, que definen cientos de componentes diferentes de la superficie celular, cada uno especificado por la unión de un anticuerpo monoclonal particular. Estos anticuerpos son extremadamente útiles para la clasificación celular activada por fluorescencia (FLS) , que permite el aislamiento específico de tipos celulares concretos.

En histopatología diagnóstica

Con la ayuda de anticuerpos monoclonales, los tejidos y órganos pueden clasificarse según la expresión de ciertos marcadores definidos, que reflejan la génesis tisular o celular. El antígeno prostático específico , la fosfatasa alcalina placentaria , la gonadotropina coriónica humana , la α-fetoproteína y otros son antígenos asociados a órganos, y la producción de anticuerpos monoclonales contra estos antígenos ayuda a determinar la naturaleza de un tumor primario. [ 2 ]

Los anticuerpos monoclonales son especialmente útiles para distinguir lesiones morfológicamente similares, como el mesotelioma pleural y peritoneal , el adenocarcinoma y para determinar el origen orgánico o tisular de las metástasis indiferenciadas . Ciertos anticuerpos monoclonales ayudan a detectar metástasis ocultas ( cáncer de origen primario desconocido ) mediante análisis inmunocitológico de médula ósea, otros aspirados tisulares, ganglios linfáticos y otros tejidos, y pueden tener una mayor sensibilidad que la tinción histopatológica normal . [ 2 ]

Un estudio [ 5 ] realizó un ensayo inmunohistoquímico sensible en aspirados de médula ósea de 20 pacientes con cáncer de próstata localizado. En el ensayo se utilizaron tres anticuerpos monoclonales (T16, C26 y AE-1), capaces de reconocer antígenos de membrana y citoesqueleto expresados ​​por células epiteliales para detectar células tumorales. Los aspirados de médula ósea del 22% de los pacientes con cáncer de próstata localizado (estadio B, 0/5; estadio C, 2/4) y del 36% de los pacientes con cáncer de próstata metastásico (estadio D1, 0/7 pacientes; estadio D2, 4/4 pacientes) presentaron células positivas para el antígeno en su médula ósea. Se concluyó que la tinción inmunohistoquímica de los aspirados de médula ósea es muy útil para detectar metástasis ocultas en la médula ósea en pacientes con cáncer de próstata aparentemente localizado.

Aunque la inmunocitoquímica con anticuerpos monoclonales asociados a tumores ha mejorado la capacidad de detectar células de cáncer de mama ocultas en aspirados de médula ósea y sangre periférica, es necesario seguir desarrollando este método antes de que pueda utilizarse de forma rutinaria. [ 6 ] Una desventaja importante de la inmunocitoquímica es que solo se utilizan anticuerpos monoclonales asociados a tumores y no específicos de tumores, y como resultado, puede producirse cierta reacción cruzada con células normales. [ 7 ]

Para estadificar eficazmente el cáncer de mama y evaluar la eficacia de los regímenes de purga previos a la infusión de células madre autólogas, es importante detectar incluso pequeñas cantidades de células cancerosas. Los métodos inmunohistoquímicos son ideales para este propósito, ya que son sencillos, sensibles y bastante específicos. Franklin et al. [ 8 ] realizaron un ensayo inmunocitoquímico sensible utilizando una combinación de cuatro anticuerpos monoclonales (260F9, 520C9, 317G5 y BrE-3) contra las glicoproteínas de la superficie de las células tumorales para identificar células tumorales de mama en la médula ósea y la sangre periférica. Concluyeron, a partir de los resultados, que la tinción inmunocitoquímica de la médula ósea y la sangre periférica es una forma sensible y sencilla de detectar y cuantificar las células de cáncer de mama.

Una de las principales causas de recidiva metastásica en pacientes con tumores sólidos es la diseminación precoz de células malignas. El uso de anticuerpos monoclonales (AcM) específicos para citoqueratinas permite identificar células tumorales epiteliales individuales diseminadas en la médula ósea.

Un estudio [ 9 ] informa sobre el desarrollo de un procedimiento inmunocitoquímico para el marcaje simultáneo del componente 18 de la citoqueratina (CK18) y el antígeno prostático específico (PSA). Esto facilitaría la caracterización de las células tumorales epiteliales diseminadas en pacientes con cáncer de próstata. Las doce muestras de control obtenidas de pacientes con hiperplasia prostática benigna mostraron tinción negativa, lo que respalda aún más la especificidad de la CK18 para la detección de células tumorales epiteliales en la médula ósea.

En la mayoría de los casos de enfermedad maligna complicada con derrame, las células neoplásicas se pueden identificar fácilmente. Sin embargo, en algunos casos, las células malignas no son tan visibles o su presencia es demasiado dudosa como para considerarlo un diagnóstico positivo. El uso de técnicas inmunocitoquímicas aumenta la precisión diagnóstica en estos casos.

Ghosh, Mason y Spriggs [ 10 ] analizaron 53 muestras de líquido pleural o peritoneal de 41 pacientes con enfermedad maligna. El examen citológico convencional no reveló células neoplásicas. Se utilizaron tres anticuerpos monoclonales (anti-CEA, Ca 1 y HMFG-2) para buscar células malignas. Se realizó un marcaje inmunocitoquímico en frotis sin teñir, que se habían almacenado a -20  °C hasta por 18 meses. Doce de los cuarenta y un casos en los que se realizó la tinción inmunocitoquímica revelaron células malignas. El resultado representó un aumento en la precisión diagnóstica de aproximadamente el 20 %. El estudio concluyó que, en pacientes con sospecha de enfermedad maligna, el marcaje inmunocitoquímico debe usarse de forma rutinaria en el examen de muestras citológicamente negativas y tiene implicaciones importantes con respecto al manejo del paciente.

Otra aplicación de la tinción inmunocitoquímica es la detección de dos antígenos en la misma muestra. La doble tinción con anticuerpos de cadena ligera y con marcadores de células T y B puede indicar el origen neoplásico de un linfoma. [ 11 ]

Un estudio ha informado del aislamiento de una línea celular de hibridoma (clon 1E10), que produce un anticuerpo monoclonal (IgM, isotipo k). Este anticuerpo monoclonal muestra tinción inmunocitoquímica específica de los nucléolos. [ 12 ]

Los tejidos y tumores pueden clasificarse según la expresión de ciertos marcadores, con la ayuda de anticuerpos monoclonales. Estos ayudan a distinguir lesiones morfológicamente similares y a determinar el origen orgánico o tisular de las metástasis indiferenciadas. El análisis inmunocitológico de médula ósea, aspirados tisulares, ganglios linfáticos, etc., con anticuerpos monoclonales seleccionados, facilita la detección de metástasis ocultas. Los anticuerpos monoclonales aumentan la sensibilidad para detectar incluso pequeñas cantidades de células invasivas o metastásicas. Los anticuerpos monoclonales (AcM) específicos para citoqueratinas pueden detectar células tumorales epiteliales individuales diseminadas en la médula ósea.

Referencias

  1. ↑ Milstein, C (1999). "La revolución del hibridoma: una ramificación de la investigación básica". BioEssays . 21 (11): 966– 73. doi : 10.1002/(SICI)1521-1878(199911)21:11 < 966::AID-BIES9 > 3.0.CO ; 2-Z . PMID 10517870 . 
  2. 1 2 3 4 5 6 Nelson, PN; Reynolds, GM; Waldron, EE; Ward, E; Giannopoulos, K; Murray, PG (2000). "Desmitificados...: Anticuerpos monoclonales" . Molecular Pathology . 53 (3): 111– 7. doi : 10.1136/mp.53.3.111 . PMC 1186915. PMID 10897328 .  
  3. ↑ Korbakis, D; Brinc, D; Schiza, C; Soosaipillai, A; Jarvi, K; Drabovich, AP; Diamandis, E (2015). "La detección mediante monitorización de reacciones seleccionadas por inmunocaptura facilita el desarrollo de ELISA para la medición de TEX101 nativo en fluidos biológicos" . Molecular & Cellular Proteomics . 14 (6): 1517– 1526. doi : 10.1074/mcp.M114.047571 . PMC 4458717. PMID 25813379 .  
  4. 1 2 Phung, Yen; Gao, Wei; Man, Yan-Gao; Nagata, Satoshi; Ho, Mitchell (septiembre de 2012). "Anticuerpos monoclonales de alta afinidad contra el antígeno tumoral de superficie celular glicano-3 generados mediante una combinación de inmunización con péptidos y cribado por citometría de flujo" . mAbs . 4 ( 5): 592– 599. doi : 10.4161/mabs.20933 . ISSN 1942-0870 . PMC 3499300. PMID 22820551 .   
  5. ↑ Bretton, PR; Melamed, MR; Fair, WR; Cote, RJ (1994). "Detección de micrometástasis ocultas en la médula ósea de pacientes con carcinoma de próstata". Prostate . 25 (2): 108– 14. doi : 10.1002/pros.2990250208 . PMID 7518596 . S2CID 32801503 .  
  6. ↑ Kvalheim, G (1996). "Detección de células tumorales ocultas en médula ósea y sangre en pacientes con cáncer de mama: métodos y significado clínico" . Acta Oncol . 35 : 13–18 . doi : 10.3109/02841869609098516 . PMID 9073044 . 
  7. ↑ Kvalheim, G (1998). "Diagnóstico de enfermedad residual mínima en médula ósea y sangre en pacientes con cáncer: métodos e implicaciones clínicas" . Acta Oncologica . 37 (5): 455– 62. doi : 10.1080/028418698430403 . PMID 9831374 . 
  8. ↑ Franklin, WA; Shpall, EJ; Archer, P; Johnston, CS; Garza-Williams, S; Hami, L; Bitter, MA; Bast, RC; Jones, RB (1996). "Detección inmunocitoquímica de células de cáncer de mama en médula ósea y sangre periférica de pacientes sometidas a quimioterapia de alta dosis con soporte de células madre autólogas". Breast Cancer Res Treat . 41 (1): 1– 13. doi : 10.1007/BF01807031 . PMID 8932871 . S2CID 37415751 .  
  9. ↑ Riesenberg, R; Oberneder, R; Kriegmair, M; Epp, M; Bitzer, U; Hofstetter, A; Braun, S; Riethmüller, G; Pantel, K (1993). "Doble tinción inmunocitoquímica de citoqueratina y antígeno prostático específico en células tumorales prostáticas individuales". Histochemistry . 99 (1): 61– 6. doi : 10.1007/BF00268022 . PMID 7682210 . S2CID 8007388 .  
  10. ↑ Ghosh, AK; Mason, DY; Spriggs, AI (1983). "Tinción inmunocitoquímica con anticuerpos monoclonales en derrames serosos citológicamente "negativos" de pacientes con enfermedad maligna" . J Clin Pathol . 36 (10): 1150– 53. doi : 10.1136/jcp.36.10.1150 . PMC 498493. PMID 6194182 .  
  11. ↑ Ghosh, AK; Spriggs, AI; Taylor-Papadimitriou, J ; Mason, DY (1983). "Tinción inmunocitoquímica de células en derrames pleurales y peritoneales con un panel de anticuerpos monoclonales" . J Clin Pathol . 36 (10): 1154–64 . doi : 10.1136/jcp.36.10.1154 . PMC 498494. PMID 6194183 .  
  12. ↑ Vissers, CJ; Flohil, CC; De Jong, AA; Dinjens, WN; Bosman, FT (1996). "Un nuevo anticuerpo monoclonal para la tinción inmunocitoquímica específica de nucléolos". Acta Histochemica . 98 (2): 113– 21. doi : 10.1016/S0065-1281(96)80028-6 . PMID 8739296 . 
  • Hibridomas en los Encabezamientos de Materias Médicas (MeSH) de la Biblioteca Nacional de Medicina de EE. UU.
  • "Tecnología de hibridoma" . Serie "Comprendiendo el cáncer: El sistema inmunitario" . Instituto Nacional del Cáncer . Archivado del original el 5 de octubre de 2014.
  • "Cultivo de células de hibridoma" . Archivado del original el 20 de febrero de 2018. Consultado el 28 de septiembre de 2017 .