Sombrero mediano

El medio HAT ( medio de hipoxantina , aminopterina y timidina ) es un medio de selección para el cultivo de células de mamíferos que se basa en la combinación de aminopterina , un fármaco que actúa como un potente inhibidor del metabolismo del folato al inhibir la dihidrofolato reductasa , con hipoxantina (un derivado de purina ) y timidina (un desoxinucleósido ), que son intermediarios en la síntesis de ADN . El truco consiste en que la aminopterina bloquea la síntesis de novo de ADN , que es absolutamente necesaria para que se produzca la división celular , pero la hipoxantina y la timidina proporcionan a las células la materia prima para eludir el bloqueo (la "vía de rescate"), siempre que tengan las enzimas adecuadas , lo que significa tener copias funcionales de los genes que las codifican.

La enzima dihidrofolato reductasa , que produce tetrahidrofolato (THF) mediante la reducción de dihidrofolato, es bloqueada específicamente por la aminopterina. El THF, al actuar en asociación con proteínas específicas , puede recibir unidades de un solo átomo de carbono que luego se transfieren a dianas específicas.

Una de las enzimas clave para la reproducción celular es la timidilato sintasa , que sintetiza timidina monofosfato (TMP) a partir de desoxiuridina monofosfato (dUMP). Mediante reacciones de fosforilación adicionales , el TMP puede transformarse en timidina trifosfato (TTP), uno de los cuatro precursores de nucleótidos que utilizan las ADN polimerasas para sintetizar ADN . Sin el THF necesario para la conversión de dUMP, no se produce TTP y la síntesis de ADN no puede llevarse a cabo, a menos que el TMP pueda obtenerse de otra fuente. Esta fuente alternativa es la timidina presente en el medio HAT, que las células pueden absorber y fosforilar mediante la timidina quinasa (TK) para formar TMP.

La síntesis de IMP (precursor de GMP y GTP, y de AMP y ATP) también requiere THF, y puede evitarse. En este caso, la hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (HGPRT) reacciona con la hipoxantina absorbida del medio y PRPP , liberando pirofosfato , para producir IMP mediante una vía de recuperación.

Por lo tanto, el uso del medio HAT para el cultivo celular constituye una forma de selección artificial de células que contienen TK y HGPRT funcionales. Numerosas mejoras útiles a este esquema son posibles gracias a venenos que matan las células, pero a los que son inmunes si carecen de uno de estos genes. Así, una célula que carece de TK es resistente a la bromodesoxiuridina (BrdU) y una célula que carece de HGPRT es resistente a la 6-tioguanina (6-TG) y a la 8-azaguanina . Por consiguiente, la selección con uno de estos dos últimos fármacos, seguida del cultivo en medio HAT, dará lugar a colonias revertantes . ^{[ 1 ]}

El medio HAT se utiliza para la preparación de anticuerpos monoclonales . Primero, se expone a animales de laboratorio (por ejemplo, ratones) a un antígeno contra el cual se desea aislar un anticuerpo . Una vez aislados los esplenocitos del mamífero, las células B se fusionan con células de mieloma inmortalizadas y negativas para HGPRT mediante polietilenglicol o el virus Sendai . Las células fusionadas se incuban en el medio HAT . La aminopterina presente en el medio bloquea la vía de síntesis de novo . Por lo tanto, las células de mieloma no fusionadas mueren, ya que no pueden producir nucleótidos ni por la vía de síntesis de novo ni por la de rescate. Las células B no fusionadas también mueren debido a su corta vida útil. De esta manera, solo sobreviven los híbridos de células B y mieloma. Estas células producen anticuerpos (una propiedad de las células B) y son inmortales (una propiedad de las células de mieloma). El medio incubado se diluye en placas de micropocillos de manera que cada pocillo contenga solo una célula. Posteriormente, se analiza el sobrenadante de cada pocillo para detectar el anticuerpo deseado. Dado que los anticuerpos en un pocillo son producidos por la misma célula B, estarán dirigidos hacia el mismo epítopo y se conocen como anticuerpos monoclonales .

La producción de anticuerpos monoclonales fue inventada por primera vez por César Milstein y Georges JF Köhler , lo que les valió el Premio Nobel de Fisiología o Medicina de 1984, compartido con Niels Kaj Jerne .