Marcaje inmunogold

El marcaje con inmunogold o tinción con inmunogold ( IGS ) es una técnica de tinción utilizada en microscopía electrónica . ^{[ 2 ]} Esta técnica de tinción es equivalente a la técnica de inmunofluorescencia indirecta para luz visible. Las partículas de oro coloidal se unen con mayor frecuencia a anticuerpos secundarios, los cuales, a su vez, se unen a anticuerpos primarios diseñados para unirse a un antígeno específico u otro componente celular . El oro se utiliza por su alta densidad electrónica , que aumenta la dispersión de electrones para producir "puntos oscuros" de alto contraste. ^{[ 3 ]}

Utilizada por primera vez en 1971, la técnica de inmunomarcaje con oro coloidal se ha aplicado tanto a la microscopía electrónica de transmisión como a la de barrido , así como a la de campo claro . Esta técnica puede adaptarse para distinguir múltiples objetos mediante el uso de partículas de oro de diferentes tamaños.

El marcaje con inmunogold puede introducir artefactos, ya que las partículas de oro se encuentran a cierta distancia del objeto marcado y se requiere un corte muy fino durante la preparación de la muestra. ^{[ 3 ]}

El marcaje con inmunogold fue utilizado por primera vez en 1971 por Faulk y Taylor para identificar antígenos de Salmonella . ^{[ 2 ] [ 4 ]} Inicialmente se aplicó en microscopía electrónica de transmisión (TEM) y fue especialmente útil para resaltar proteínas que se encuentran en bajas densidades, como ciertos antígenos de la superficie celular. ^{[ 5 ]} A medida que mejoró la resolución de la microscopía electrónica de barrido (SEM), también lo hizo la necesidad de marcadores del tamaño de nanopartículas como el inmunogold. En 1975, Horisberger y sus colegas visualizaron con éxito nanopartículas de oro con un diámetro de menos de 30 nm ^{[ 6 ]} y esto pronto se convirtió en una técnica establecida de SEM. ^{[ 5 ]} 

Primero, se corta una sección delgada de la muestra, a menudo utilizando un micrótomo . ^{[ 7 ]} Luego pueden tener lugar varias otras etapas de preparación de la muestra .

La muestra preparada se incuba con un anticuerpo específico diseñado para unirse a la molécula de interés. ^{[ 3 ]} A continuación, se añade un anticuerpo secundario con partículas de oro unidas, que se une al anticuerpo primario. El oro también puede unirse a la proteína A o a la proteína G en lugar de un anticuerpo secundario, ya que estas proteínas se unen a las regiones Fc de la IgG de mamíferos de forma no específica. ^{[ 6 ]}

La partícula de oro densa en electrones puede entonces verse bajo un microscopio electrónico como un punto negro, etiquetando indirectamente la molécula de interés. ^{[ 3 ]}

El marcaje con inmunogold se puede utilizar para visualizar más de un objetivo simultáneamente. En microscopía electrónica , esto se puede lograr utilizando dos partículas de oro de diferente tamaño. ^{[ 8 ]} Una extensión de este método ha utilizado tres partículas de oro de diferente tamaño para rastrear la localización de péptidos reguladores . ^{[ 9 ]} Un enfoque más complejo para el marcaje de múltiples sitios implica marcar por separado los lados opuestos de un sitio antigénico ; las partículas de inmunogold unidas a ambos lados se pueden observar simultáneamente. ^{[ 10 ]}

Aunque el marcaje con inmunogold se utiliza normalmente para la microscopía electrónica de transmisión, cuando el oro se realza con plata, se puede observar mediante microscopía de campo claro . ^{[ 11 ]} El realce con plata aumenta el tamaño de las partículas, lo que también permite la microscopía electrónica de barrido.

Para producir partículas de oro potenciadas con plata, se coloca oro coloidal en una solución potenciadora ácida que contiene iones de plata . Las partículas de oro actúan como sitios de nucleación , y la plata se deposita sobre ellas. Un ejemplo de marcaje inmunogold potenciado con plata (IGSS) es su uso en la identificación del patógeno Erwinia amylovora . ^{[ 11 ]}

Una limitación inherente a la técnica de inmunogold es que la partícula de oro se encuentra a unos 15-30  nm del sitio al que se une el anticuerpo primario ^{[ 5 ]} (cuando se utiliza una estrategia de marcaje con anticuerpos primarios y secundarios ). Por lo tanto, no es posible calcular con precisión la ubicación de la molécula objetivo. Se pueden crear partículas de oro con un diámetro de 1 nm (o menor), pero entonces surge otra limitación: a estos tamaños, el marcador de oro resulta difícil de distinguir de la estructura del tejido. ^{[ 2 ] [ 5 ]} 

Para el marcaje con inmunogold se requieren secciones delgadas, las cuales pueden generar imágenes engañosas; una sección delgada de un componente celular puede no ofrecer una visión precisa de su estructura tridimensional . Por ejemplo, un microtúbulo puede aparecer como una "espiga" dependiendo del plano en el que se haya realizado el corte. Para superar esta limitación, se pueden tomar secciones seriadas, las cuales luego se pueden compilar en una imagen tridimensional . ^{[ 3 ]}

Otra limitación es que los anticuerpos y las partículas de oro no pueden penetrar la resina utilizada para incrustar las muestras para su visualización. Por lo tanto, solo se pueden seleccionar y visualizar las moléculas accesibles. El marcaje previo a la incrustación de la muestra puede reducir el impacto negativo de esta limitación. ^{[ 3 ]}

• Inmunohistoquímica