Inmunoprecipitación

Consiste en utilizar un anticuerpo específico para una proteína conocida , con el fin de aislar dicha proteína de una solución que contiene diversas proteínas. Estas soluciones suelen consistir en un lisado bruto de tejido vegetal o animal. Otros tipos de muestras pueden ser fluidos corporales u otras muestras de origen biológico.

La inmunoprecipitación de complejos proteicos intactos (es decir, el antígeno junto con las proteínas o ligandos unidos a él) se conoce como co-inmunoprecipitación (Co-IP). La Co-IP funciona seleccionando un anticuerpo que se dirige a una proteína conocida que se cree que forma parte de un complejo proteico mayor. Al dirigir el anticuerpo hacia este miembro conocido , es posible aislar el complejo proteico completo de la solución y, de este modo, identificar miembros desconocidos del complejo.

Esto funciona cuando las proteínas que componen el complejo se unen firmemente entre sí, lo que permite extraer varios miembros del complejo de la solución mediante la unión de un anticuerpo a uno de ellos. Este concepto de extracción de complejos proteicos de la solución se conoce a veces como "pull-down". La co-inmunoprecipitación (Co-IP) es una técnica potente que los biólogos moleculares utilizan habitualmente para analizar las interacciones proteína-proteína .

• Un anticuerpo específico suele seleccionar una subpoblación de su proteína diana que tiene el epítopo expuesto, por lo que no logra identificar las proteínas en complejos que ocultan dicho epítopo. Esto se evidencia en que rara vez es posible precipitar siquiera la mitad de una proteína determinada a partir de una muestra con un solo anticuerpo, incluso cuando se utiliza un gran exceso de este.
• A medida que se realizan sucesivas rondas de selección e inmunoprecipitación, el número de proteínas identificadas puede seguir aumentando. Es posible que las proteínas identificadas nunca existan en un único complejo en un momento dado, sino que representen una red de proteínas que interactúan entre sí en diferentes momentos con distintos propósitos.
• Repetir el experimento analizando diferentes miembros del complejo proteico permite al investigador verificar el resultado. Cada ronda de inmunoprecipitación debería resultar en la recuperación tanto de la proteína original conocida como de otros miembros del complejo previamente identificados (e incluso nuevos miembros adicionales). Al repetir la inmunoprecipitación de esta manera, el investigador verifica que cada miembro identificado del complejo proteico sea una identificación válida. Si una proteína en particular solo se puede recuperar analizando uno de los miembros conocidos, pero no los demás, entonces su pertenencia al complejo podría ponerse en duda.

La inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) es un método utilizado para determinar la ubicación de los sitios de unión al ADN en el genoma para una proteína de interés específica. Esta técnica proporciona una imagen de las interacciones proteína-ADN que ocurren dentro del núcleo de células o tejidos vivos . La naturaleza in vivo de este método contrasta con otros enfoques empleados tradicionalmente para responder a las mismas preguntas.

El principio fundamental de este ensayo es que las proteínas de unión al ADN (incluidos los factores de transcripción y las histonas ) en las células vivas pueden entrecruzarse con el ADN al que se unen. Mediante el uso de un anticuerpo específico para una proteína de unión al ADN putativa, se puede inmunoprecipitar el complejo proteína-ADN a partir de lisados ​​celulares. El entrecruzamiento se suele lograr aplicando formaldehído a las células (o tejido), aunque a veces resulta ventajoso utilizar un agente de entrecruzamiento más definido y consistente, como el dimetil 3,3′-ditiobispropionimidato-2 HCl (DTBP). ^{[ 1 ]} Tras el entrecruzamiento, las células se lisan y el ADN se fragmenta en trozos de 0,2 a 1,0 kb mediante sonicación . En este punto, se realiza la inmunoprecipitación, lo que da como resultado la purificación de los complejos proteína-ADN. Los complejos proteína-ADN purificados se calientan para revertir el entrecruzamiento con formaldehído de los complejos proteína-ADN, lo que permite separar el ADN de las proteínas. La identidad y cantidad de los fragmentos de ADN aislados se pueden determinar mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La limitación de realizar PCR en los fragmentos aislados radica en que es necesario conocer la región genómica objetivo para generar los cebadores de PCR correctos. En ocasiones, esta limitación se sortea clonando el ADN genómico aislado en un vector plasmídico y utilizando cebadores específicos para la región de clonación de dicho vector. Alternativamente, cuando se desea determinar dónde se une la proteína a escala genómica, se utiliza la secuenciación ChIP , que recientemente se ha consolidado como una tecnología estándar para localizar sitios de unión de proteínas de forma rentable y a gran escala, permitiendo además la caracterización del cistroma . Anteriormente, también se utilizaba la técnica de microarrays de ADN ( ChIP-on-chip o ChIP-chip ).

Tanto RIP como CLIP purifican una proteína de unión a ARN específica para identificar los ARN unidos, estudiando así las ribonucleoproteínas (RNP). ^{[ 2 ] [ 3 ]} En RIP , los ARN copurificados se extraen y su enriquecimiento se compara con el control, que originalmente se hizo mediante microarrays o RT-PCR . En CLIP , las células se reticulan con UV antes de la lisis, seguido de pasos de purificación adicionales más allá de la inmunoprecipitación estándar, incluyendo la fragmentación parcial del ARN, lavado con alta concentración de sal, separación por SDS-PAGE y transferencia de membrana, e identificación de sitios de unión directa al ARN mediante secuenciación de ADNc .

Uno de los principales obstáculos técnicos de la inmunoprecipitación es la gran dificultad para generar un anticuerpo que se dirija específicamente a una proteína conocida. Para superar este obstáculo, muchos grupos modifican genéticamente el extremo C o N de la proteína de interés añadiendo etiquetas . La ventaja reside en que la misma etiqueta puede utilizarse repetidamente en diversas proteínas, y el investigador puede emplear el mismo anticuerpo en cada ocasión. Las ventajas de utilizar proteínas marcadas son tan significativas que esta técnica se ha generalizado en todos los tipos de inmunoprecipitación, incluyendo los descritos anteriormente. Algunos ejemplos de etiquetas utilizadas son la proteína verde fluorescente (GFP), la glutatión-S-transferasa (GST) y la etiqueta FLAG . Si bien el uso de una etiqueta para realizar ensayos de pull-down resulta práctico, plantea ciertas dudas sobre su relevancia biológica, ya que la propia etiqueta puede enmascarar interacciones naturales o introducir interacciones nuevas y no naturales.

Los anticuerpos específicos para una proteína (o grupo de proteínas) se inmovilizan en un sustrato sólido, como microesferas superparamagnéticas o microesferas de agarosa (no magnéticas). A continuación, las microesferas con los anticuerpos unidos se añaden a la mezcla de proteínas, y las proteínas a las que se dirigen los anticuerpos se unen a las microesferas mediante estos; es decir, se produce una inmunoprecipitación.

Los anticuerpos específicos para una proteína en particular, o un grupo de proteínas, se añaden directamente a la mezcla proteica. Los anticuerpos aún no se han fijado a un soporte de fase sólida. Flotan libremente en la mezcla proteica y se unen a sus dianas. Con el tiempo, se añaden microesferas recubiertas con proteína A/G a la mezcla de anticuerpos y proteínas. En este punto, los anticuerpos, ahora unidos a sus dianas, se adhieren a las microesferas.

A partir de este punto, los protocolos directo e indirecto convergen, ya que las muestras ahora tienen los mismos ingredientes. Ambos métodos dan el mismo resultado final: la proteína o los complejos proteicos se unen a los anticuerpos, los cuales están inmovilizados en las microesferas.

En ocasiones, se prefiere un método indirecto cuando la concentración de la proteína diana es baja o cuando la afinidad específica del anticuerpo por la proteína es débil. Este método también se utiliza cuando la cinética de unión del anticuerpo a la proteína es lenta por diversas razones. En la mayoría de los casos, el método directo es la opción predeterminada y preferida.

Históricamente, el soporte de fase sólida para inmunoprecipitación utilizado por la mayoría de los científicos han sido las microesferas de agarosa altamente porosas (también conocidas como resinas o suspensiones de agarosa). La ventaja de esta tecnología radica en su elevada capacidad de unión, ya que prácticamente toda la estructura esponjosa de la partícula de agarosa (de 50 a 150  μm de tamaño) está disponible para la unión de anticuerpos (que a su vez se unirán a las proteínas diana), y permite el uso de equipos de laboratorio estándar para todos los aspectos del protocolo de inmunoprecipitación sin necesidad de equipos especializados. Esta ventaja de una capacidad de unión tan elevada debe sopesarse cuidadosamente con la cantidad de anticuerpo que el investigador esté dispuesto a utilizar para recubrir las microesferas de agarosa. Dado que los anticuerpos pueden ser un factor limitante en los costos, lo mejor es calcular a la inversa, partiendo de la cantidad de proteína que se necesita capturar (según el análisis posterior), la cantidad de anticuerpo necesaria para unirse a esa cantidad de proteína (con un pequeño exceso añadido para compensar las ineficiencias del sistema), y aún más atrás, la cantidad de agarosa necesaria para unirse a esa cantidad específica de anticuerpo. En los casos en que no se requiere la saturación de anticuerpos, esta tecnología es inigualable en su capacidad para capturar cantidades extremadamente grandes de proteínas objetivo. La salvedad es que la "ventaja de alta capacidad" puede convertirse en una "desventaja de alta capacidad" que se manifiesta cuando la enorme capacidad de unión de las perlas de sefarosa /agarosa no se satura completamente con anticuerpos. A menudo sucede que la cantidad de anticuerpo disponible para el investigador en su experimento de inmunoprecipitación es insuficiente para saturar las perlas de agarosa que se utilizarán en la inmunoprecipitación. En estos casos, el investigador puede terminar con partículas de agarosa recubiertas solo parcialmente con anticuerpos, y la porción de la capacidad de unión de las perlas de agarosa que no está recubierta con anticuerpos queda libre para unirse a cualquier cosa que se adhiera, lo que resulta en una señal de fondo elevada debido a la unión no específica de componentes del lisado a las perlas, lo que puede dificultar la interpretación de los datos. Si bien algunos podrían argumentar que, por estas razones, es prudente igualar la cantidad de agarosa (en términos de capacidad de unión) a la cantidad de anticuerpo que se desea unir para la inmunoprecipitación, una forma sencilla de reducir el problema de la unión no específica a las perlas de agarosa y aumentar la especificidad es preclarificar el lisado, lo cual es altamente recomendable para cualquier inmunoprecipitación. ^{[ 4 ] [ 5 ]}

Si bien la gran mayoría de las inmunoprecipitaciones se realizan con perlas de agarosa, el uso de perlas superparamagnéticas para inmunoprecipitación es un enfoque más reciente que está ganando popularidad como alternativa a las perlas de agarosa para aplicaciones de IP. A diferencia de la agarosa, las perlas magnéticas son sólidas y pueden ser esféricas, según el tipo de perla, y la unión del anticuerpo se limita a la superficie de cada perla. Si bien estas perlas no tienen la ventaja de un centro poroso para aumentar la capacidad de unión, las perlas magnéticas son significativamente más pequeñas que las perlas de agarosa (de 1 a 4  μm), y la mayor cantidad de perlas magnéticas por volumen en comparación con las perlas de agarosa les confiere una relación superficie-volumen efectiva para una unión óptima del anticuerpo.

Las microesferas magnéticas disponibles comercialmente se pueden clasificar, según su uniformidad de tamaño, en monodispersas y polidispersas . Las microesferas monodispersas presentan una uniformidad exacta, por lo que todas exhiben características físicas idénticas, incluyendo la capacidad de unión y el nivel de atracción magnética. Las microesferas polidispersas, si bien son similares en tamaño a las monodispersas, muestran una amplia variabilidad de tamaño (de 1 a 4 μm) que puede influir en su capacidad de unión y captura magnética. Aunque ambos tipos de microesferas están disponibles comercialmente para aplicaciones de inmunoprecipitación, las microesferas superparamagnéticas monodispersas de mayor calidad son más idóneas para protocolos automatizados debido a su tamaño, forma y rendimiento consistentes. Numerosas empresas, como Invitrogen , Thermo Scientific y Millipore  , ofrecen microesferas superparamagnéticas monodispersas y polidispersas .

Los defensores de las perlas magnéticas afirman que estas exhiben una velocidad de unión de proteínas más rápida ^{[ 7 ] [ 8 ] [ 9 ]} que las perlas de agarosa para aplicaciones de inmunoprecipitación, aunque las inmunoprecipitaciones estándar basadas en perlas de agarosa se han realizado en 1 hora. ^{[ 5 ]} También se ha afirmado que las perlas magnéticas son mejores para inmunoprecipitar complejos proteicos extremadamente grandes debido a la completa ausencia de un límite de tamaño superior para dichos complejos, ^{[ 7 ] [ 8 ] [ 10 ]} aunque no hay evidencia imparcial que respalde esta afirmación. La naturaleza de la tecnología de perlas magnéticas resulta en una menor manipulación de muestras ^{[ 8 ]} debido al estrés físico reducido en las muestras de la separación magnética en comparación con la centrifugación repetida cuando se usa agarosa, lo que puede contribuir en gran medida a aumentar el rendimiento de complejos proteicos lábiles (frágiles). ^{[ 8 ] [ 9 ] [ 10 ]} Sin embargo, en la selección de un soporte de inmunoprecipitación se deben considerar factores adicionales, como la capacidad de unión, el costo del reactivo, la necesidad de equipo adicional y la capacidad de automatizar los procesos de IP.

Una vez seleccionada la tecnología de microesferas de sustrato sólido, se acoplan anticuerpos a las microesferas y estas recubiertas con anticuerpos se añaden a la muestra de proteína heterogénea (por ejemplo, tejido homogeneizado). En este punto, los anticuerpos inmovilizados en las microesferas se unen a las proteínas que reconocen específicamente. Una vez completado este proceso, la inmunoprecipitación se da por finalizada, ya que las proteínas de interés se unen a los anticuerpos inmovilizados en las microesferas. La separación de los inmunocomplejos del lisado es un paso crucial, dado que las proteínas deben permanecer unidas entre sí (en el caso de la co-inmunoprecipitación) y al anticuerpo durante los lavados para eliminar las proteínas no unidas y reducir el ruido de fondo.

Al trabajar con perlas de agarosa, estas deben separarse de la muestra mediante una breve centrifugación a una fuerza de entre 600 y 3000 xg (multiplicada por la gravedad estándar). Este paso puede realizarse en un tubo de microcentrífuga estándar, pero para una separación más rápida, mayor consistencia y mejores recuperaciones, el proceso suele llevarse a cabo en pequeñas columnas de centrifugación con un tamaño de poro que permite el paso del líquido, pero no de las perlas de agarosa. Tras la centrifugación, las perlas de agarosa formarán un sedimento esponjoso y poco denso en el fondo del tubo. El sobrenadante que contiene contaminantes puede retirarse cuidadosamente para no alterar las perlas. A continuación, se añade el tampón de lavado a las perlas y, tras mezclarlas, se separan de nuevo mediante centrifugación.

Con las microesferas superparamagnéticas, la muestra se coloca en un campo magnético para que las microesferas se adhieran a la pared del tubo. Este procedimiento suele completarse en unos 30 segundos, y el líquido restante (no deseado) se retira con una pipeta. Los lavados se realizan resuspendiendo las microesferas (fuera del imán) con la solución de lavado y concentrándolas de nuevo en la pared del tubo (al volver a colocar el tubo sobre el imán). El lavado se repite varias veces para asegurar la eliminación adecuada de contaminantes. Si las microesferas superparamagnéticas tienen un tamaño homogéneo y el imán está diseñado correctamente, las microesferas se concentrarán uniformemente en la pared del tubo y la solución de lavado se podrá eliminar fácil y completamente.

Tras el lavado, la(s) proteína(s) precipitada(s) se eluyen y analizan mediante electroforesis en gel , espectrometría de masas , transferencia Western o cualquier otro método para identificar los componentes del complejo. Los tiempos de protocolo para la inmunoprecipitación varían considerablemente debido a diversos factores, aumentando con el número de lavados necesarios o con la cinética de reacción más lenta de las perlas de agarosa porosa.

1. Lisar las células y preparar la muestra para la inmunoprecipitación.
2. Pre-clarifique la muestra haciéndola pasar sobre microesferas solas o unidas a un anticuerpo irrelevante para absorber cualquier proteína que se una de forma no específica a los componentes de la inmunoprecipitación.
3. Incubar la solución con el anticuerpo contra la proteína de interés. El anticuerpo puede fijarse al soporte sólido antes de este paso (método directo) o después (método indirecto). Continuar la incubación para permitir la formación de complejos anticuerpo-antígeno.
4. Precipitar el complejo de interés, separándolo de la solución principal.
5. Lave el complejo precipitado varias veces. Centrifugue entre lavados si usa perlas de agarosa o coloque el tubo sobre un imán si usa perlas superparamagnéticas y luego retire el sobrenadante. Después del último lavado, retire la mayor cantidad de sobrenadante posible.
6. Eluya las proteínas del soporte sólido utilizando un tampón de carga de muestras de pH bajo o SDS.
7. Analizar complejos o antígenos de interés. Esto se puede hacer de diversas maneras:
   1. Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio ( SDS-PAGE ) seguida de tinción del gel.
   2. Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) seguida de: tinción del gel, recorte de las bandas de proteínas teñidas individualmente y secuenciación de las proteínas en las bandas mediante espectrometría de masas de desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI) .
   3. Transferencia y Western blot utilizando otro anticuerpo para las proteínas que interactuaban con el antígeno, seguido de la detección mediante un anticuerpo secundario quimioluminiscente o fluorescente .