Hispanopedia WikiLas pruebas de toxicidad in vitro son el análisis científico de losefectos tóxicos de las sustancias químicas en bacterias o células de mamíferos cultivadas. [ 1 ] Los métodos de prueba in vitro (literalmente "en vidrio") se emplean principalmente para identificar sustancias químicas potencialmente peligrosas y/o para confirmar la ausencia de ciertas propiedades tóxicas en las primeras etapas del desarrollo de nuevas sustancias potencialmente útiles, como fármacos terapéuticos , agroquímicos y aditivos alimentarios.
Recientemente, agencias gubernamentales clave (p. ej., EPA; NIEHS/NTP; FDA) están considerando cuidadosamente los ensayos in vitro para la toxicidad de xenobióticos, con el fin de evaluar mejor los riesgos para la salud humana. Se están realizando importantes actividades para utilizar sistemas in vitro que permitan comprender mejor los mecanismos de acción de los tóxicos, así como el uso de células y tejidos humanos para definir los efectos tóxicos específicos en humanos. [ 2 ]
Mejora con respecto a las pruebas en animales.
La mayoría de los toxicólogos consideran que los métodos de prueba de toxicidad in vitro pueden ser más útiles, eficientes en tiempo y costes que los estudios toxicológicos en animales vivos [ 3 ] (denominados métodos in vivo o "en vida"). Sin embargo, la extrapolación de los resultados in vitro a los in vivo requiere una cuidadosa consideración y constituye un área de investigación activa.
Debido a las restricciones regulatorias y las consideraciones éticas, la búsqueda de alternativas a las pruebas con animales ha cobrado un nuevo impulso. En muchos casos, las pruebas in vitro son mejores que las pruebas con animales porque pueden utilizarse para desarrollar productos más seguros. [ 4 ]
La Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos estudió 1.065 sustancias químicas y medicamentos en su programa ToxCast (que forma parte del CompTox Chemicals Dashboard ) utilizando modelos en sílice y un ensayo basado en células madre pluripotentes humanas para predecir intoxicaciones del desarrollo in vivo basándose en los cambios en el metabolismo celular tras la exposición a sustancias químicas. Los principales hallazgos del análisis de este conjunto de datos ToxCast_STM publicado en 2020 incluyen: (1) el 19% de 1065 sustancias químicas produjeron una predicción de toxicidad del desarrollo , (2) el rendimiento del ensayo alcanzó una precisión del 79% al 82% con alta especificidad (> 84%) pero sensibilidad modesta (< 67%) cuando se comparó con modelos animales in vivo de toxicidad del desarrollo prenatal humano, (3) la sensibilidad mejoró a medida que se aplicaron requisitos de ponderación de la evidencia más estrictos a los estudios en animales, y (4) el análisis estadístico de los compuestos químicos más potentes en objetivos bioquímicos específicos en ToxCast reveló asociaciones positivas y negativas con la respuesta STM, lo que proporciona información sobre los fundamentos mecanísticos del punto final objetivo y su dominio biológico. [ 5 ]
Ejemplos de ensayos de viabilidad celular y otros ensayos de citotoxicidad utilizados para toxicología in vitro .
Existen numerosos métodos de análisis para evaluar la citotoxicidad y otras respuestas celulares de las sustancias de prueba.
Ensayo de hemólisis
El ensayo de hemólisis examina la propensión de sustancias químicas, fármacos o medicamentos , o cualquier dispositivo o material médico en contacto con la sangre, a lisar los glóbulos rojos (eritrocitos). La lisis se detecta fácilmente debido a la liberación de hemoglobina . [ 6 ]
MTT y MTS
El ensayo MTT se utiliza frecuentemente para determinar la viabilidad celular y ha sido validado por organizaciones internacionales. Este ensayo consta de dos pasos: primero, se introducen los reactivos en el ensayo y, posteriormente, se lleva a cabo una etapa de solubilización.
El ensayo in vitro colorimétrico MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio) es una versión actualizada del método MTT validado. El ensayo MTS tiene la ventaja de ser soluble, por lo que no requiere un paso de solubilización.
ATP
El ensayo de ATP tiene la principal ventaja de proporcionar resultados rápidamente (en 15 minutos) y solo requiere una pequeña cantidad de células de muestra. El ensayo realiza la lisis de las células y la posterior reacción química entre el ensayo y el contenido de ATP de las células produce luminiscencia. La cantidad de luminiscencia se mide luego con un fotómetro y se puede traducir en número de células vivas ya que
- El ensayo de ATP supone que las células vivas todavía tienen ATP en su interior, y
- El nivel de luminiscencia registrado es proporcional al contenido de ATP en las células de la muestra.
Rojo neutro
Otro indicador de viabilidad celular es la captación de rojo neutro (RN). El rojo neutro, un colorante catiónico débil, penetra las membranas celulares sin difusión y se acumula intracelularmente en los lisosomas. Las células viables captan el colorante RN, mientras que las células dañadas o muertas no.
Cuantificación de citocinas mediante ELISA
Los kits ELISA se pueden utilizar para examinar la regulación positiva y negativa de mediadores proinflamatorios como las citoquinas (IL-1, TNF alfa, PGE2)...
La medición de este tipo de respuestas celulares puede ofrecer una perspectiva de la interacción del elemento de prueba con los modelos de prueba (cultivos celulares monocapa, modelos de tejido 3D, explantes de tejido).
Tipos de estudios in vitro
En términos generales, existen dos tipos diferentes de estudios in vitro, según el tipo de sistema desarrollado para realizar el experimento. Los dos tipos de sistemas que se utilizan habitualmente son : a) el sistema de placas de pocillos estáticas y b) los sistemas perfundidos multicompartimentales.
Sistema de placas de pozos estáticos
Los sistemas de placas de pocillos estáticas son la forma más tradicional y sencilla de realizar ensayos, ampliamente utilizados en estudios in vitro. Estos ensayos son muy beneficiosos, ya que son bastante simples y proporcionan un entorno de prueba muy accesible para monitorizar sustancias químicas tanto en el medio de cultivo como en las células. Sin embargo, la desventaja de utilizar estos sencillos ensayos en placas de pocillos estáticas es que no pueden representar las interacciones celulares ni las condiciones fisiológicas de flujo de fluidos que tienen lugar dentro del organismo.
Sistemas de perfusión multicompartimentales
Actualmente se están desarrollando nuevas plataformas de prueba para resolver problemas relacionados con las interacciones celulares. Estas nuevas plataformas son mucho más complejas y se basan en sistemas perfundidos multicompartimentales. [ 7 ] El objetivo principal de estos sistemas es reproducir los mecanismos in vivo de forma más fiable, proporcionando un entorno de cultivo celular similar al de un organismo vivo. Cada compartimento del sistema representa un órgano específico del organismo vivo y, por lo tanto, posee características y criterios específicos. Cada compartimento está conectado mediante tubos y bombas por los que fluye el fluido, imitando así el flujo sanguíneo in vivo. La desventaja del uso de estos sistemas perfundidos radica en que los efectos adversos (influencia de los componentes biológicos y no biológicos del sistema sobre el destino de la sustancia química en estudio) son mayores en comparación con los sistemas estáticos. Para reducir el efecto de los componentes no biológicos, todos los compartimentos están fabricados de vidrio y los tubos de conexión de teflón. Se han propuesto diversos modelos cinéticos para abordar las uniones no específicas que tienen lugar en estos sistemas in vitro. [ 8 ]
Para mejorar las dificultades biológicas derivadas del uso de diferentes condiciones de cultivo in vitro, es necesario modificar los modelos tradicionales empleados en matraces o placas de micropocillos. Con el desarrollo paralelo de las microtecnologías y la ingeniería de tejidos, estos problemas se resuelven mediante nuevas herramientas pertinentes denominadas "biochips microfluídicos". [ 9 ]
Referencias
- ↑ Gavanji S, Bakhtari A, Famurewa AC, Othman EM (enero de 2023). "Actividad citotóxica de medicamentos a base de hierbas evaluada in vitro: una revisión" . Química y Biodiversidad . 20 (2): 3– 27. doi : 10.1002/cbdv.202201098 . PMID 36595710. S2CID 255473013 .
- ↑ "Tox21" . Fuente: Agencia de Protección Ambiental de EE . UU. Consultado el 29 de octubre de 2011 .
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- ↑ "Visión y hoja de ruta para el siglo XXI" . Fuente: Programa Nacional de Toxicología . Consultado el 29 de octubre de 2011 .
- ↑ Zurlinden, TJ; Saili, KS; Rush, N; Kothiya, P; Judson, RS; Houck, KA; Hunter, ES; Baker, NC; Palmer, JA; Thomas, RS; Knudson, TB (2020). "Perfilado de la biblioteca ToxCast con un ensayo de biomarcadores basado en la línea celular de células madre pluripotentes humanas (H9) para la toxicidad del desarrollo" . Toxicological Sciences . 174 (2): 189– 209. doi : 10.1093/toxsci/kfaa014 . PMC 8527599. PMID 32073639 .
- ↑ Sæbø PI, Bjørås M, Franzyk H, Helgensen E, Booth J (2 de febrero de 2023). "Optimización del ensayo de hemólisis para la evaluación de la citotoxicidad" . Int . J. Mol. Sci . 24 (3): 2914. doi : 10.3390/ijms24032914 . PMC 9917735. PMID 36769243 .
- ↑ Leclerc E.; Sakai Y.; Fujii T. (2004). "Cultivo por perfusión de hepatocitos fetales humanos en entornos microfluídicos". Biochemical Engineering Journal . 20 ( 2– 3): 143– 148. Bibcode : 2004BioEJ..20..143L . doi : 10.1016/j.bej.2003.09.010 .
- ↑ Ouattara DA; Choi S.-H.; Sakai Y.; Pery ARR; Brochot C. (2011). "Modelado cinético de ensayos celulares in vitro para caracterizar uniones no específicas y procesos ADME en un sistema fluido estático y perfundido". Toxicology Letters . 205 (3): 310– 319. doi : 10.1016/j.toxlet.2011.06.021 . PMID 21723928 .
- ↑ Baudoin R.; Corlu A.; Griscom L.; Legallais C.; Leclerc E. (2007). "Tendencias en el desarrollo de biochips celulares microfluídicos para hepatotoxicidad in vitro". Toxicology in Vitro . 21 (4): 535– 544. Bibcode : 2007ToxVi..21..535B . doi : 10.1016/j.tiv.2006.11.004 . PMID 17188836 .
- Toxicología
- Alternativas a la experimentación con animales