mutagénesis por inserción

En biología molecular , la mutagénesis por inserción es la creación de mutaciones en el ADN mediante la adición de uno o más pares de bases . Estas mutaciones por inserción pueden ocurrir de forma natural, mediadas por virus o transposones , o pueden crearse artificialmente con fines de investigación en el laboratorio.

Esta técnica se utiliza para estudiar la función de los genes . Se permite que un transposón , como el elemento P de Drosophila melanogaster, se integre aleatoriamente en el genoma del organismo estudiado. Los mutantes generados mediante este método se analizan para detectar fenotipos inusuales . Si se encuentra un fenotipo de este tipo, se puede asumir que la inserción ha provocado la inactivación del gen responsable de dicho fenotipo. Dado que se conoce la secuencia del transposón, el gen puede identificarse mediante la secuenciación del genoma completo o mediante la reacción en cadena de la polimerasa para amplificar específicamente ese gen.

Debido a que muchos virus integran sus genomas en los de las células huésped para replicarse, la mutagénesis causada por infecciones virales es bastante común. Sin embargo, no todos los virus que se integran provocan mutagénesis por inserción.

Algunas inserciones de ADN no producen mutaciones perceptibles. Históricamente, los vectores lentivirales incluían promotores virales fuertes que tenían como efecto secundario la mutagénesis por inserción, mutaciones del ADN nuclear que afectan la función de un gen. ^{[ 1 ]} Se demostró que estos promotores virales fuertes eran la principal causa de la formación de cáncer . ^{[ 1 ]} Como resultado, los promotores virales han sido reemplazados por promotores celulares y secuencias reguladoras. ^{[ 1 ]} Para aquellos virus como los gammaretrovirus que tienden a integrar su ADN en ubicaciones genéticamente desfavorables, la gravedad de cualquier mutación resultante depende completamente de la ubicación dentro del genoma del huésped donde se inserta el ADN viral. Si el ADN se inserta en medio de un gen esencial, los efectos en la célula serán drásticos. Además, la inserción en la región promotora de un gen puede tener efectos igualmente drásticos. Del mismo modo, si el ADN viral se inserta en un represor , el gen correspondiente del promotor puede sobreexpresarse, lo que lleva a una sobreabundancia de su producto y a una actividad celular alterada. Si el ADN se inserta en la región potenciadora de un gen , este puede expresarse de forma insuficiente, lo que conlleva una ausencia relativa de su producto y puede interrumpir significativamente la actividad de la célula.

La alteración de diferentes genes tendrá efectos variables en la célula. No todas las mutaciones afectarán significativamente la proliferación celular. Sin embargo, si la inserción se produce en un gen esencial o en un gen implicado en la replicación celular o la muerte celular programada , puede comprometer la viabilidad de la célula o incluso provocar que se replique indefinidamente, lo que puede dar lugar a la formación de un tumor, que podría volverse canceroso.

La mutagénesis por inserción es posible tanto si el virus es del tipo autoinactivante comúnmente utilizado en la terapia génica como si es capaz de replicarse. El virus inserta un gen (conocido como oncogén viral) normalmente cerca del gen celular myc (c-myc). El gen c-myc normalmente está inactivo en la célula; sin embargo, cuando se activa, puede impulsar a la célula a la fase G1 del ciclo celular y provocar que la célula comience a replicarse, causando una proliferación celular descontrolada mientras permite que el gen viral se replique. Después de muchas replicaciones en las que el gen viral permanece latente, comienzan a crecer tumores. Estos tumores normalmente se derivan de una célula mutada/ transformada (de origen clonal). El virus de la leucosis aviar es un ejemplo de un virus que causa enfermedad por mutagénesis por inserción. Los polluelos recién nacidos infectados con el virus de la leucosis aviar comenzarán a formar tumores que aparecerán en su bolsa de Fabricio (similar al timo humano). Esta inserción génica viral también se conoce como inserción de promotor, ya que impulsa la expresión del gen c-myc. Existe un ejemplo de mutagénesis por inserción causada por un retrotransposón en el genoma humano, que provoca la distrofia muscular de tipo Fukuyama. ^{[ 2 ]}

La inactivación por inserción es una técnica utilizada en la ingeniería de ADN recombinante donde se utiliza un plásmido (como pBR322 ) ^{[ 3 ] para desactivar la expresión de un gen. [ 4 ]}

La inactivación de un gen mediante la inserción de un fragmento de ADN en medio de su secuencia codificante. Los productos futuros derivados del gen inactivado no funcionarán debido a los códigos adicionales añadidos. Un ejemplo es el uso del plásmido pBR322, que contiene genes que codifican polipéptidos que confieren resistencia a los antibióticos ampicilina y tetraciclina, respectivamente. Por lo tanto, cuando una región genética se interrumpe por la integración de pBR322, se pierde la función del gen, pero se adquiere una nueva función (resistencia a antibióticos específicos).

Se ha utilizado una estrategia alternativa de mutagénesis por inserción en vertebrados para encontrar genes causantes de cáncer. En este caso, se diseña un transposón, por ejemplo Sleeping Beauty , para interrumpir un gen de tal manera que cause el máximo daño genético. Específicamente, el transposón contiene señales para truncar la expresión de un gen interrumpido en el sitio de inserción y luego reiniciar la expresión de un segundo gen truncado. Este método se ha utilizado para identificar oncogenes . ^{[ 5 ] [ 6 ]}

• Mutagénesis por inserción en los encabezamientos de materias médicas (MeSH) de la Biblioteca Nacional de Medicina de EE. UU.
• Diagrama en gene-technology-online.com