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Mutagénesis dirigida al sitio

La mutagénesis dirigida es un método de biología molecular que se utiliza para generar mutaciones específicas e intencionadas en una secuencia de ADN particular , como un gen , ...

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La mutagénesis dirigida es un método de biología molecular que se utiliza para generar mutaciones específicas e intencionadas en una secuencia de ADN particular , como un gen , o en sus productos génicos . También conocida como mutagénesis sitio-específica o mutagénesis dirigida por oligonucleótidos , se utiliza ampliamente para investigar la estructura y la actividad biológica de moléculas de ADN , ARN y proteínas , así como para la ingeniería de proteínas . El término abarca numerosas técnicas que funcionan mediante una amplia variedad de mecanismos distintos, todos con el mismo objetivo: crear una o más mutaciones de nucleótidos precisas y dirigidas (ya sean inserciones, deleciones o sustituciones) dentro de una secuencia de ácido nucleico específica.

La mutagénesis dirigida sigue siendo uno de los métodos de laboratorio más importantes para crear bibliotecas de ADN mediante la introducción de mutaciones en secuencias de ADN, pero con la disminución de los costos de la síntesis de novo de oligonucleótidos , la síntesis de genes artificiales se ha convertido en una alternativa cada vez más común a la mutación de secuencias de ADN existentes. Se siguen desarrollando nuevas técnicas para lograr la mutagénesis dirigida. Por ejemplo, el desarrollo de las tecnologías CRISPR /Cas9, basadas en un sistema de defensa viral procariota, ha permitido la edición precisa y dirigida del genoma in vivo , lo que a veces se considera un tipo de mutagénesis dirigida. [ 1 ]

Historia

Los primeros intentos de mutagénesis utilizando radiación o mutágenos químicos no fueron específicos del sitio, sino que generaron mutaciones aleatorias en ubicaciones impredecibles. [ 2 ] Posteriormente se utilizaron análogos de ácidos nucleicos y otros químicos para generar mutaciones puntuales localizadas ; [ 3 ] ejemplos de tales químicos incluyen aminopurina , [ 4 ] nitrosoguanidina , [ 5 ] y bisulfito . [ 6 ] La mutagénesis dirigida al sitio se logró por primera vez en 1974 en el laboratorio de Charles Weissmann utilizando el análogo de nucleótido N 4 -hidroxicitidina, que induce mutaciones de transición de GC a AT. [ 7 ] [ 8 ] Sin embargo, estos métodos de mutagénesis están limitados por los tipos de mutación que pueden lograr, y es más probable que resulten en mutaciones no específicas, fuera del objetivo que los métodos de mutagénesis dirigida al sitio posteriores.

En 1971, Clyde Hutchison y Marshall Edgell demostraron que es posible producir mutantes con pequeños fragmentos del fago ΦX174 y nucleasas de restricción . [ 9 ] [ 10 ] Posteriormente, Hutchison produjo con su colaborador Michael Smith un enfoque más flexible para la mutagénesis dirigida al sitio mediante el uso de oligonucleótidos en un método de extensión de cebadores con ADN polimerasa . [ 11 ] Por su participación en el desarrollo de este proceso, Smith compartió posteriormente el Premio Nobel de Química en octubre de 1993 con Kary B. Mullis , quien inventó la reacción en cadena de la polimerasa .

Mecanismo básico

El procedimiento básico de mutagénesis dirigida requiere la síntesis de un cebador corto de oligonucleótido de ADN . Este cebador sintético contiene la mutación deseada y es complementario a la secuencia de ADN que rodea el sitio de mutación, de modo que puede hibridar con la plantilla de ADN. La mutación puede consistir en una o más sustituciones de bases ( mutación puntual ), deleciones o inserciones . El cebador monocatenario se utiliza como punto de partida para la síntesis de una nueva molécula de ADN mediante la ADN polimerasa , que copia el resto del gen a partir de la plantilla complementaria. La molécula recién sintetizada contiene el sitio mutado y se introduce en una célula huésped en un vector plasmídico para su clonación . Finalmente, se utiliza la secuenciación del ADN plasmídico purificado de las colonias cultivadas a partir de las células transformadas para comprobar que contienen la mutación deseada.

Aproches

El método original que utilizaba la extensión con un solo cebador era ineficiente debido a la baja producción de mutantes. La mezcla resultante contiene tanto la plantilla original no mutada como la hebra mutante, lo que produce una población mixta de progenies mutantes y no mutantes. Además, la plantilla utilizada está metilada , mientras que la hebra mutante no lo está, y los mutantes pueden ser contraseleccionados debido a la presencia de un sistema de reparación de errores de apareamiento que favorece el ADN de la plantilla metilada, lo que resulta en una menor cantidad de mutantes. Desde entonces, se han desarrollado muchos enfoques para mejorar la eficiencia de la mutagénesis.

Actualmente se dispone de un gran número de técnicas para lograr la mutagénesis dirigida a sitios específicos, [ 12 ] aunque la mayoría de ellas rara vez se han utilizado en laboratorios desde principios de la década de 2000, ya que las técnicas más nuevas han permitido formas más rápidas y sencillas de introducir mutaciones específicas en los genes.

El método de Kunkel

En 1985, Thomas Kunkel introdujo una técnica que reduce la necesidad de seleccionar mutantes. [ 13 ] El fragmento de ADN que se va a mutar se inserta en un fagemido como M13mp18/19 y luego se transforma en una cepa de E. coli deficiente en dos enzimas, dUTPasa ( dut ) y uracilo desglucosidasa ( udg ). Ambas enzimas forman parte de una vía de reparación del ADN que protege el cromosoma bacteriano de mutaciones mediante la desaminación espontánea de dCTP a dUTP. La deficiencia de dUTPasa impide la degradación de dUTP, lo que resulta en un alto nivel de dUTP en la célula. La deficiencia de uracilo desglucosidasa impide la eliminación de uracilo del ADN recién sintetizado. A medida que la E. coli doble mutante replica el ADN del fago, su maquinaria enzimática puede, por lo tanto, incorporar erróneamente dUTP en lugar de dTTP, lo que resulta en ADN monocatenario que contiene algunos uracilos (ssUDNA). El ADN monocatenario sin uracilo (ssUDNA) se extrae del bacteriófago liberado en el medio y se utiliza como molde para la mutagénesis. Se emplea un oligonucleótido con la mutación deseada para la extensión del cebador. El ADN heteroduplex resultante consta de una cadena parental no mutada que contiene dUTP y una cadena mutada que contiene dTTP. Posteriormente, este ADN se introduce en una cepa de E. coli portadora de los genes dut y udg de tipo silvestre . En esta etapa, la cadena de ADN parental que contiene uracilo se degrada, de modo que casi todo el ADN resultante consiste en la cadena mutada.

Mutagénesis de casete

A diferencia de otros métodos, la mutagénesis por casete no requiere la extensión del cebador mediante ADN polimerasa. En este método, se sintetiza un fragmento de ADN y se inserta en un plásmido. [ 14 ] Consiste en la escisión por una enzima de restricción en sitios de restricción del plásmido y la posterior ligación en el plásmido de un par de oligonucleótidos complementarios que contienen la mutación en el gen de interés. Generalmente, las enzimas de restricción que cortan en el plásmido y el oligonucleótido son las mismas, lo que permite que los extremos cohesivos del plásmido y del inserto se liguen entre sí. Este método puede generar mutantes con una eficiencia cercana al 100%, pero está limitado por la disponibilidad de sitios de restricción adecuados que flanqueen el sitio que se va a mutar.

Mutagénesis dirigida por sitio mediante PCR

Representación de una forma común de clonar una biblioteca de mutagénesis dirigida (es decir, utilizando oligonucleótidos degenerados). El gen de interés se amplifica mediante PCR con oligonucleótidos que contienen una región perfectamente complementaria a la plantilla (azul) y otra que difiere de la plantilla en uno o más nucleótidos (rojo). Muchos de estos cebadores que contienen degeneración en la región no complementaria se combinan en la misma PCR, lo que da como resultado muchos productos de PCR diferentes con distintas mutaciones en esa región (los mutantes individuales se muestran con diferentes colores a continuación).

La limitación de los sitios de restricción en la mutagénesis de casete puede superarse mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR ) con cebadores de oligonucleótidos , de modo que se genere un fragmento mayor que abarque dos sitios de restricción convenientes. La amplificación exponencial en la PCR produce un fragmento que contiene la mutación deseada en cantidades suficientes para separarlo del plásmido original no mutado mediante electroforesis en gel , el cual puede insertarse posteriormente en el contexto original utilizando técnicas estándar de biología molecular recombinante. Existen muchas variantes de esta técnica. El método más sencillo sitúa el sitio de mutación hacia uno de los extremos del fragmento, de manera que uno de los dos oligonucleótidos utilizados para generarlo contiene la mutación. Esto implica un solo paso de PCR, pero aún presenta el problema inherente de requerir un sitio de restricción adecuado cerca del sitio de mutación, a menos que se utilice un cebador muy largo. Por lo tanto, otras variantes emplean tres o cuatro oligonucleótidos, dos de los cuales pueden ser oligonucleótidos no mutagénicos que abarquen dos sitios de restricción convenientes y generen un fragmento que pueda digerirse y ligarse a un plásmido, mientras que el oligonucleótido mutagénico puede ser complementario a una ubicación dentro de ese fragmento alejada de cualquier sitio de restricción conveniente. Estos métodos requieren múltiples pasos de PCR para que el fragmento final a ligar contenga la mutación deseada. El proceso de diseño para generar un fragmento con la mutación deseada y los sitios de restricción relevantes puede ser engorroso. Herramientas de software como SDM-Assist [ 15 ] pueden simplificar el proceso.

Mutagénesis de plásmidos completos

Para la manipulación de plásmidos, otras técnicas de mutagénesis dirigida han sido sustituidas en gran medida por técnicas altamente eficientes pero relativamente simples, fáciles de usar y disponibles comercialmente como kit. Un ejemplo de estas técnicas es el método "Quikchange" [ 16 ] , en el que se utiliza un par de cebadores mutagénicos complementarios para amplificar el plásmido completo en una reacción de termociclado utilizando una ADN polimerasa de alta fidelidad que no desplaza la cadena, como la polimerasa Pfu . La reacción genera una molécula de ADN circular con una muesca . El ADN molde debe eliminarse mediante digestión enzimática con una enzima de restricción como Dpn I , que es específica para el ADN metilado. Todo el ADN replicado en las células de la mayoría de las cepas de Escherichia coli está metilado; por lo tanto, el plásmido molde que se biosintetiza en E. coli será digerido, mientras que el plásmido mutado, que se genera in vitro y, por lo tanto, no está metilado, quedará sin digerir. Cabe señalar que, en estos métodos de mutagénesis de plásmidos de doble cadena, si bien se puede utilizar la reacción de termociclado, el ADN no se amplifica exponencialmente si los dos cebadores están diseñados para unirse simétricamente a la misma región alrededor del sitio de mutagénesis, como se describe en el protocolo original. En este caso, la amplificación es lineal y, por lo tanto, es inexacto describir el procedimiento como PCR, ya que no hay reacción en cadena. Sin embargo, si los cebadores están diseñados para unirse de forma desplazada, de modo que el sitio de mutagénesis esté cerca de los extremos 5' de ambos cebadores, las regiones 3' de los cebadores también pueden unirse a los productos amplificados y, por lo tanto, se observa la formación exponencial de productos. El nombre "Quikchange" proviene de la marca registrada "QuikChange mutagenesis" de Stratagene , ahora Agilent Technologies , para kits de mutagénesis dirigida. El método fue desarrollado por científicos que trabajaban en Stratagene. [ 16 ]

Cabe señalar que la polimerasa Pfu puede desplazar la cadena a temperaturas de extensión elevadas (≥70  °C), lo que puede provocar el fallo del experimento; por lo tanto, la reacción de extensión debe realizarse a la temperatura recomendada de 68  °C. En algunas aplicaciones, se ha observado que este método produce la inserción de múltiples copias de cebadores. [ 17 ] Una variante de este método, denominada SPRINP, previene estos artefactos y se ha utilizado en diferentes tipos de mutagénesis dirigida. [ 17 ]

Otras técnicas, como la mutagénesis de escaneo de objetivos dirigidos por oligonucleótidos (SMOOT), pueden combinar de forma semi-aleatoria oligonucleótidos mutagénicos en la mutagénesis de plásmidos. [ 18 ] Esta técnica puede crear bibliotecas de mutagénesis de plásmidos que abarcan desde mutaciones individuales hasta mutagénesis de codones completa en todo un gen.

Métodos de mutagénesis dirigida in vivo

  • Delitto perfetto [ 19 ]
  • Traslado "entrada y salida rápida"
  • Eliminación directa de genes y mutagénesis sitio-específica con PCR y un marcador reciclable.
  • Eliminación directa de genes y mutagénesis sitio-específica con PCR y un marcador reciclable utilizando regiones homólogas largas.
  • Mutagénesis dirigida al sitio in vivo con oligonucleótidos sintéticos [ 20 ]

CRISPR

Desde 2013, el desarrollo de las tecnologías de edición genómica CRISPR /Cas9 ha permitido la introducción eficiente de diversas mutaciones en el ADN genómico de una amplia variedad de organismos. Este método no requiere un sitio de inserción de transposón , no deja marcadores y su eficiencia y simplicidad lo han convertido en el método preferido para la edición genómica. [ 21 ] [ 22 ]

Aplicaciones

La mutagénesis por saturación de sitio es un tipo de mutagénesis dirigida. Esta imagen muestra la mutagénesis por saturación de una sola posición en una proteína teórica de 10 residuos. La versión de tipo silvestre de la proteína se muestra en la parte superior, donde M representa el primer aminoácido, metionina, y * representa un codón de parada, donde finaliza la traducción. Los 19 mutantes de la isoleucina en la posición 5 se muestran a continuación.

La mutagénesis dirigida se utiliza para generar mutaciones que pueden producir una proteína diseñada racionalmente con propiedades mejoradas o especiales (es decir, ingeniería de proteínas).

Herramientas de investigación : las mutaciones específicas en el ADN permiten investigar la función y las propiedades de una secuencia de ADN o una proteína de forma racional. Además, los cambios de un solo aminoácido mediante mutagénesis dirigida en proteínas pueden ayudar a comprender la importancia de las modificaciones postraduccionales. Por ejemplo, cambiar una serina (fosfoaceptor) por una alanina (fosfonoaceptor) en una proteína sustrato bloquea la unión de un grupo fosfato, lo que permite investigar la fosforilación. Este método se ha utilizado para descubrir la fosforilación de la proteína CBP por la quinasa HIPK2 [ 23 ]. Otro método integral es la mutagénesis de saturación de sitio , donde un codón o un conjunto de codones se pueden sustituir por todos los aminoácidos posibles en posiciones específicas [ 24 ] .

Aplicaciones comerciales : Las proteínas pueden modificarse genéticamente para producir formas mutantes adaptadas a una aplicación específica. Por ejemplo, los detergentes para ropa de uso común pueden contener subtilisina , cuya forma silvestre posee una metionina que puede oxidarse con lejía, reduciendo significativamente la actividad de la proteína en el proceso. [ 25 ] Esta metionina puede sustituirse por alanina u otros residuos, lo que la hace resistente a la oxidación y, por lo tanto, mantiene la proteína activa en presencia de lejía. [ 26 ]

síntesis genética

A medida que disminuye el costo de la síntesis de oligonucleótidos de ADN, la síntesis artificial de un gen completo de novo se ha convertido en un método viable para introducir mutaciones en los genes. Este método permite una mutagénesis extensa en múltiples sitios, incluyendo el rediseño completo del uso de codones del gen para optimizar su expresión en un organismo específico. [ 27 ]

Véase también

Referencias

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  • Conferencia Nobel sobre la invención de la mutagénesis dirigida.
  • OpenWetWare
  • Diagrama que resume la mutagénesis dirigida a sitios específicos.