Etiquetado isobárico

El marcaje isobárico es una estrategia de espectrometría de masas utilizada en proteómica cuantitativa . Los péptidos o proteínas se marcan con grupos químicos que tienen una masa nominalmente idéntica (isobáricos), pero que varían en la distribución de isótopos pesados ​​en su estructura. Estas etiquetas, comúnmente denominadas etiquetas de masas en tándem , están diseñadas para que la etiqueta de masas se escinda en una región de enlace específica tras la disociación inducida por colisión de alta energía (HCD) durante la espectrometría de masas en tándem, generando iones reporteros de diferentes masas.

Las etiquetas isobáricas más comunes son las etiquetas reactivas a aminas. ^{[ 1 ]} Sin embargo, también se han descrito etiquetas que reaccionan con residuos de cisteína y grupos carbonilo. ^{[ 2 ]} Estos grupos reactivos a aminas pasan por reacciones de N-hidroxisuccinimida (NHS) , que se basan en tres tipos de grupos funcionales. ^{[ 2 ]} Los métodos de marcaje isobárico incluyen etiquetas de masa en tándem (TMT) , etiquetas isobáricas para cuantificación relativa y absoluta (iTRAQ) , etiquetas diferenciales de masa para cuantificación absoluta y relativa, y marcaje con dimetilo. ^{[ 1 ]} Los métodos TMT e iTRAQ son los más comunes y desarrollados de estos métodos. ^{[ 1 ]} Las etiquetas de masa en tándem tienen una región reportera de masa, una región de enlace escindible, una región de normalización de masa y un grupo reactivo a proteínas, y tienen la misma masa total. ^{[ 3 ]}

Un flujo de trabajo típico de proteómica de abajo hacia arriba se describe en (Yates, 2014). ^{[ 2 ]} Las muestras de proteínas se digieren enzimáticamente con una proteasa para producir péptidos. Cada muestra experimental digerida es derivada de un conjunto con una variante isotópica diferente de la etiqueta. Las muestras se mezclan en proporciones generalmente iguales y se analizan simultáneamente en una corrida de MS. Dado que las etiquetas son isobáricas y tienen propiedades químicas idénticas, las variantes isotópicas de las etiquetas aparecen como un único pico compuesto con el mismo valor m/z en un escaneo MS1 con tiempos de retención de cromatografía líquida (LC) idénticos. Durante el análisis MS2 y tras la fragmentación, cada variante isotópica de la etiqueta produce iones producto específicos de secuencia. Estos iones producto se utilizan para determinar la secuencia del péptido y las etiquetas reporteras cuyas abundancias reflejan la proporción relativa del péptido en las muestras combinadas. El uso de MS/MS es necesario para detectar las etiquetas; por lo tanto, los péptidos no marcados no se cuantifican.

Explicado previamente por (Lee, Choe, Aggarwal, 2017). ^{[ 4 ]} Una ventaja clave del marcaje isobárico sobre otras técnicas de cuantificación (por ejemplo, sin marcaje) es la capacidad de multiplexación y, por lo tanto, el mayor potencial de rendimiento. La capacidad de combinar y analizar varias muestras simultáneamente en una sola corrida de LC-MS elimina la necesidad de analizar múltiples conjuntos de datos y elimina la variación entre corridas. La multiplexación reduce la variabilidad del procesamiento de muestras, mejora la especificidad al cuantificar los péptidos de cada condición simultáneamente y reduce el tiempo de respuesta para múltiples muestras. Sin multiplexación, se puede perder información entre corridas, lo que afecta la identificación y cuantificación, ya que los péptidos seleccionados para la fragmentación en una corrida de LC-MS/MS pueden no estar presentes o en cantidad adecuada en corridas de muestras posteriores. Las etiquetas químicas isobáricas disponibles actualmente facilitan el análisis simultáneo de 2 a 11 muestras experimentales.

El marcaje isobárico se ha utilizado con éxito en numerosas aplicaciones biológicas, incluyendo la identificación y cuantificación de proteínas, el perfil de expresión proteica en estados normales y anormales, el análisis cuantitativo de proteínas para las que no se dispone de anticuerpos y la identificación y cuantificación de proteínas modificadas postraduccionalmente. ^{[ 4 ]}

Existen dos tipos de etiquetas isobáricas disponibles comercialmente: etiquetas de masas en tándem (TMT) y etiquetas isobáricas para cuantificación relativa y absoluta (iTRAQ) . Las TMT reactivas a aminas están disponibles en conjuntos dúplex, de 6, 10 y ahora de 11. ^{[ 5 ]} Las iTRAQ reactivas a aminas están disponibles en formatos de 4 y 8. ^{[ 6 ]}