Enfoque isoeléctrico

El enfoque isoeléctrico ( IEF ), también conocido como electroenfoque , es una técnica para separar moléculas cargadas diferentes según sus puntos isoeléctricos (pI). ^{[ 1 ] [ 2 ]} Es un tipo de electroforesis zonal que se realiza habitualmente en proteínas en gel y que aprovecha el hecho de que la carga total de la molécula de interés, es decir, la densidad de carga neta , es función del pH de su entorno. ^{[ 3 ]}

La IEF implica la adición de una solución de anfolito a geles de gradiente de pH inmovilizado (IPG). Los IPG son una matriz de gel de acrilamida copolimerizada con el gradiente de pH, lo que da como resultado gradientes completamente estables, excepto para los valores de pH más alcalinos (>12). El gradiente de pH inmovilizado se obtiene mediante el cambio continuo en la proporción de inmobilinas . Una inmobilina es un ácido o base débil definido por su valor de pK.

Una proteína cuyo pH sea inferior a su punto isoeléctrico (pI) tendrá carga positiva y, por lo tanto, migrará hacia el cátodo (electrodo con carga negativa). Sin embargo, a medida que migra a través de un gradiente de pH creciente, la carga total de la proteína disminuirá hasta alcanzar el pH correspondiente a su pI. En este punto, no tiene carga neta y, por consiguiente, la migración cesa (ya que no existe atracción eléctrica hacia ninguno de los electrodos). Como resultado, las proteínas se agrupan en bandas estacionarias bien definidas, y cada proteína se sitúa en un punto del gradiente de pH que corresponde a su pI. Esta técnica permite una resolución extremadamente alta, fraccionando en bandas separadas proteínas que difieren en una sola carga.

Las moléculas que se desean analizar se distribuyen en un medio con un gradiente de pH (generalmente creado por anfolitos alifáticos ). Se aplica una corriente eléctrica al medio, creando un ánodo positivo y un cátodo negativo . Las moléculas con carga negativa migran a través del gradiente de pH hacia el extremo positivo, mientras que las moléculas con carga positiva se mueven hacia el extremo negativo. A medida que una partícula se desplaza hacia el polo opuesto a su carga, lo hace a través del gradiente de pH cambiante hasta alcanzar el punto isoeléctrico de dicha molécula. En este punto, la molécula ya no tiene carga eléctrica neta (debido a la protonación o desprotonación de los grupos funcionales asociados) y, por lo tanto, no continuará su recorrido dentro del gel. El gradiente se establece antes de añadir las partículas de interés, sometiendo primero a electroforesis una solución de moléculas pequeñas, como polianfolitos con diferentes valores de pI.

El método se aplica con especial frecuencia en el estudio de proteínas , que se separan según su contenido relativo de residuos ácidos y básicos , cuyo valor está representado por el pI. Las proteínas se introducen en un gel con gradiente de pH inmovilizado, compuesto de poliacrilamida , almidón o agarosa , donde se ha establecido un gradiente de pH. Generalmente se utilizan geles con poros grandes en este proceso para eliminar cualquier efecto de "tamizado" o artefactos en el pI causados ​​por diferentes velocidades de migración para proteínas de distintos tamaños. El enfoque isoeléctrico puede resolver proteínas que difieren en un valor de pI de tan solo 0,01. ^{[ 4 ]} El enfoque isoeléctrico es el primer paso en la electroforesis bidimensional en gel , en la que las proteínas se separan primero por su valor de pI y luego por su peso molecular mediante SDS-PAGE . Por otro lado, el enfoque isoeléctrico es el único paso en la PAGE nativa preparativa a pH constante. ^{[ 5 ]}

Según algunas opiniones, ^{[ 6 ] [ 7 ]} las células eucariotas vivas realizan el enfoque isoeléctrico de proteínas en su interior para superar la limitación de la velocidad de reacción metabólica causada por la difusión de enzimas y sus reactivos, y para regular la velocidad de procesos bioquímicos específicos. Al concentrar las enzimas de vías metabólicas particulares en regiones pequeñas y distintas de su interior, la célula puede aumentar la velocidad de dichas vías bioquímicas en varios órdenes de magnitud. Mediante la modificación del punto isoeléctrico (pI) de las moléculas de una enzima, por ejemplo, mediante fosforilación o desfosforilación, la célula puede transferir moléculas de la enzima entre diferentes partes de su interior para activar o desactivar procesos bioquímicos específicos.

La electroforesis basada en microchips es una alternativa prometedora a la electroforesis capilar , ya que tiene el potencial de proporcionar un análisis rápido de proteínas, una integración sencilla con otras operaciones unitarias microfluídicas, detección de canal completo, películas de nitrocelulosa, tamaños de muestra más pequeños y menores costos de fabricación.

La creciente demanda de herramientas de separación de proteínas más rápidas y fáciles de usar ha acelerado la evolución de la IEF hacia separaciones en solución. En este contexto, se desarrolló un sistema IEF de múltiples uniones para realizar separaciones IEF rápidas y sin gel. El sistema IEF de múltiples uniones utiliza una serie de recipientes con un capilar que pasa a través de cada uno. ^{[ 8 ]} Parte del capilar en cada recipiente se reemplaza por una membrana semipermeable. Los recipientes contienen soluciones tampón con diferentes valores de pH, de modo que se establece un gradiente de pH dentro del capilar. La solución tampón en cada recipiente tiene un contacto eléctrico con un divisor de voltaje conectado a una fuente de alimentación de alto voltaje, que establece un campo eléctrico a lo largo del capilar. Cuando se inyecta una muestra (una mezcla de péptidos o proteínas) en el capilar, la presencia del campo eléctrico y el gradiente de pH separan estas moléculas según sus puntos isoeléctricos. El sistema IEF de múltiples uniones se ha utilizado para separar mezclas de péptidos trípticos para proteómica bidimensional ^{[ 9 ]} y proteínas del plasma sanguíneo de pacientes con enfermedad de Alzheimer para el descubrimiento de biomarcadores. ^{[ 8 ]}