Eliminación genética

La recombinación homóloga es el intercambio de genes entre dos cadenas de ADN que incluyen extensas regiones de secuencias de bases idénticas. En especies eucariotas, bacterias y algunos virus, la recombinación homóloga ocurre espontáneamente y es una herramienta útil en ingeniería genética. La recombinación homóloga, que tiene lugar durante la meiosis en eucariotas, es esencial para la reparación de roturas de doble cadena de ADN y promueve la variación genética al permitir el movimiento de información genética durante el entrecruzamiento cromosómico. La recombinación homóloga, un mecanismo clave de reparación del ADN en bacterias, permite la inserción de material genético adquirido mediante transferencia horizontal de genes y su transformación en ADN. La recombinación homóloga en virus influye en el curso de la evolución viral. La recombinación homóloga, un tipo de manipulación genética utilizada en ingeniería genética, implica la introducción de una mutación diseñada en un gen específico para obtener más información sobre su función. Este método consiste en insertar ADN extraño en una célula que tiene una secuencia similar al gen objetivo, flanqueada por secuencias idénticas aguas arriba y aguas abajo del gen objetivo. El ADN del gen objetivo se sustituye por la secuencia de ADN extraño durante la replicación cuando la célula detecta las regiones flanqueantes similares como homólogas. El gen objetivo se "desactiva" mediante este intercambio. Al utilizar esta técnica para dirigirnos a alelos específicos en células madre embrionarias de ratones, es posible crear ratones knockout. Con la ayuda de la focalización genética, se han desactivado numerosos genes de ratón, lo que ha llevado a la creación de cientos de modelos de ratón distintos de diversas enfermedades humanas, como cáncer, diabetes, enfermedades cardiovasculares y trastornos neurológicos. Mario Capecchi, Sir Martin J. Evans y Oliver Smithies realizaron una investigación pionera sobre la recombinación homóloga en células madre de ratón y compartieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina de 2007 por sus hallazgos. ^{[ 5 ]} Tradicionalmente, la recombinación homóloga era el método principal para causar la desactivación de un gen. Este método consiste en crear una construcción de ADN que contiene la mutación deseada. Para fines de inactivación génica, esto generalmente implica un marcador de resistencia a fármacos en lugar del gen inactivado deseado. ^{[ 6 ]} La construcción también contendrá un mínimo de 2 kb de homología con la secuencia objetivo. La construcción se puede introducir en las células madre mediante microinyección o electroporación . Este método se basa en los mecanismos de reparación propios de la célula para recombinar la construcción de ADN con el ADN existente. Esto da como resultado la alteración de la secuencia del gen y, en la mayoría de los casos, el gen se traducirá.en una proteína no funcional , si es que se traduce. Sin embargo, este es un proceso ineficiente, ya que la recombinación homóloga representa solo de 10 ⁻² a 10 ⁻³ integraciones de ADN. ^{[ 6 ] [ 7 ]} A menudo, el marcador de selección de fármacos en el constructo se utiliza para seleccionar células en las que ha ocurrido el evento de recombinación.

Estas células madre, ahora sin el gen, podrían utilizarse in vivo , por ejemplo en ratones, insertándolas en embriones tempranos. Si el ratón quimérico resultante contuviera la alteración genética en su línea germinal, esta podría transmitirse a la descendencia. ^{[ 6 ]}

En los organismos diploides , que contienen dos alelos para la mayoría de los genes y que también pueden contener varios genes relacionados que colaboran en la misma función, se realizan rondas adicionales de transformación y selección hasta que se inactiva cada gen objetivo. Puede ser necesario el cruzamiento selectivo para producir animales homocigotos con el gen inactivado.

Actualmente se utilizan tres métodos que implican la selección precisa de una secuencia de ADN para introducir una rotura de doble cadena. Una vez que esto ocurre, los mecanismos de reparación de la célula intentarán reparar esta rotura, a menudo mediante la unión de extremos no homólogos (NHEJ), que consiste en la ligación directa de los dos extremos cortados. ^{[ 7 ]} Esto puede hacerse de forma imperfecta, lo que a veces provoca inserciones o deleciones de pares de bases, causando mutaciones de cambio de marco de lectura . Estas mutaciones pueden hacer que el gen en el que ocurren sea no funcional, creando así una inactivación de ese gen. Este proceso es más eficiente que la recombinación homóloga y, por lo tanto, puede utilizarse más fácilmente para crear inactivaciones bialélicas. ^{[ 7 ]}

La técnica de inserción génica es similar a la de eliminación génica, pero consiste en reemplazar un gen por otro en lugar de eliminarlo.

^{La eliminación condicional de} un gen permite la supresión de un gen en un tejido de forma específica. Esto es necesario en lugar de la eliminación completa del gen si la mutación nula provocara la muerte embrionaria [ ^{15 ]} o si se desea estudiar un tejido o tipo celular específico. Esto se logra introduciendo secuencias cortas llamadas sitios loxP alrededor del gen. Estas secuencias se introducen en la línea germinal mediante el mismo mecanismo que la eliminación completa. Esta línea germinal se puede cruzar con otra línea germinal que contenga la recombinasa Cre, una enzima viral que reconoce estas secuencias, las recombina y elimina el gen flanqueado por estos sitios ^{[ 16 ]} . Posteriormente, se han creado y empleado otras recombinasas en experimentos de eliminación condicional ^{[ 17 ] .}