Imágenes de células individuales vivas

En cualquier estudio de células individuales vivas, el primer paso es introducir un marcador para nuestra proteína/molécula de interés en una línea celular adecuada. Gran parte del crecimiento en este campo se debe a la mejora de las herramientas de edición genética, como CRISPR , lo que ha llevado al desarrollo de una amplia variedad de marcadores fluorescentes. ^{[ 12 ]}

El marcaje fluorescente utiliza un gen que codifica una proteína fluorescente, la cual se inserta en el marco de lectura de la proteína que se desea marcar. A partir de las imágenes de la proteína marcada, se pueden extraer características de textura e intensidad.

Las moléculas también pueden ser marcadas in vitro e introducidas en la célula mediante electroforesis . Esto permite el uso de fluoróforos más pequeños y fotoestables, pero requiere pasos de lavado adicionales. ^{[ 13 ]}

Al diseñar la expresión del reportero FRET de manera que los fluoróforos donador y emisor solo se encuentren cerca cuando una molécula de señalización anterior esté activa o inactiva, la relación de intensidad de fluorescencia entre el donador y el emisor puede utilizarse como medida de la actividad de señalización. Por ejemplo, en trabajos iniciales clave que utilizaron reporteros FRET para estudios de células individuales vivas, se diseñaron reporteros FRET de la actividad de la GTPasa Rho . ^{[ 14 ]}

Los reporteros de translocación nuclear utilizan señales de importación y exportación nuclear diseñadas , que pueden ser inhibidas por moléculas de señalización, para registrar la actividad de señalización a través de la relación entre el reportero nuclear y el reportero citoplasmático. ^{[ 15 ]}

Posteriormente, se debe realizar la microscopía de células vivas marcadas con fluorescencia. Esto requiere la incubación simultánea de las células en condiciones libres de estrés mientras se realiza la microscopía. Existen varios factores que deben tenerse en cuenta al elegir las condiciones de microscopía, como la fototoxicidad, el fotoblanqueo , la facilidad de seguimiento, la tasa de cambio de la actividad de señalización y la relación señal/ruido. Todos estos factores están relacionados con la frecuencia de adquisición de imágenes y la intensidad de la iluminación.

La fototoxicidad puede resultar de la exposición a grandes cantidades de luz durante periodos prolongados. Las células se estresan, lo que puede provocar apoptosis . La obtención de imágenes de alta frecuencia e intensidad puede causar una disminución de la señal del fluoróforo por fotoblanqueo. Generalmente, la obtención de imágenes de mayor frecuencia facilita el seguimiento celular automatizado. Las frecuencias de imagen deben ser capaces de capturar los cambios necesarios en la actividad de señalización. La obtención de imágenes de baja intensidad o el uso de marcadores deficientes pueden impedir la detección de bajos niveles de actividad de señalización dentro de la célula.

Tras la obtención de imágenes de células vivas, se emplea un software de seguimiento automatizado para extraer datos de series temporales de vídeos de células. El seguimiento de células vivas generalmente se divide en dos pasos: segmentación de imágenes de células o sus núcleos y seguimiento de células/núcleos basado en estos segmentos. Aún existen muchos desafíos en esta etapa de un estudio de imágenes de células individuales vivas. ^{[ 16 ]} Sin embargo, se han destacado avances recientes en el campo, como la primera comparación objetiva de técnicas de seguimiento de células individuales. ^{[ 17 ]}

La imagen de fase cuantitativa (QPI) es particularmente útil para el seguimiento de células vivas. Dado que la QPI no requiere marcadores, no induce fototoxicidad ni sufre el fotoblanqueo asociado con la imagen de fluorescencia. ^{[ 18 ]} La QPI ofrece un contraste significativamente mayor que las técnicas de imagen de fase convencionales, como la microscopía de contraste de fase . Este mayor contraste facilita una segmentación y un seguimiento celular más robustos que los que se pueden lograr con la imagen de fase convencional. ^{[ 19 ]}

También se están utilizando cada vez más nuevas técnicas que combinan técnicas tradicionales de segmentación de imágenes con aprendizaje profundo para segmentar células. ^{[ 20 ]}

En la etapa final de un estudio de imágenes de células individuales vivas, se realiza el modelado y análisis de datos de series temporales extraídos de células rastreadas. Se pueden construir perfiles de árbol genealógico para revelar la heterogeneidad en la respuesta celular individual y la señalización posterior. ^{[ 21 ] [ 22 ]} El refinamiento y la compresión de datos del seguimiento de células individuales basado en video pueden proporcionar entradas relevantes para el análisis de big data, contribuyendo a la identificación de biomarcadores para un mejor diagnóstico y pronóstico. ^{[ 23 ]} Existe una gran superposición entre el análisis de datos de células individuales vivas y el modelado de sistemas biológicos utilizando ecuaciones diferenciales ordinarias . Los resultados de este paso clave del análisis de datos impulsarán experimentación adicional, por ejemplo, perturbando aspectos del sistema en estudio y luego comparando la dinámica de señalización con la de la población de control.