Análisis de ganglios linfáticos locales

El ensayo de ganglios linfáticos locales en ratones (LLNA) es una prueba in vivo para la sensibilización de la piel .

La prueba LLNA ha reemplazado en gran medida a la prueba de maximización en cobayas y a la prueba de Buehler . Se considera más científica y menos cruel (menor número de animales; menos sufrimiento) y ha obtenido una amplia aceptación científica y regulatoria.

El principio subyacente a la LLNA es que los sensibilizadores cutáneos inducen el crecimiento de linfocitos en los ganglios linfáticos que drenan el sitio de aplicación. La proliferación de linfocitos se puede medir mediante marcaje radiactivo (cuantificando timidina tritiada ), bioluminiscencia (cuantificando el contenido de ATP en los linfocitos) o inmunoensayo ( ELISA utilizando un anticuerpo específico para BrdU ). ^{[ 1 ]}

El material de prueba se aplica en las orejas de ratones. Opcionalmente, se inyecta intraperitonealmente una sustancia marcadora, como 3H-metil- timidina o BrdU, para su incorporación en linfocitos. Los animales son sacrificados y se extraen y analizan las células de sus ganglios linfáticos. La proporción de incorporación del marcador en los ganglios linfáticos de los animales tratados se compara con la de los animales control, obteniéndose un índice de estimulación (IE). Cuando el índice de estimulación supera 3 (IE > 3), se asume un potencial de sensibilización relevante. A diferencia de las pruebas clásicas con cobayas, la LLNA proporciona una medición cuantitativa de la potencia de sensibilización de la sustancia química analizada. ^{[ 2 ]}

La prueba LLNA podría no ser adecuada para ciertos compuestos metálicos, tensioactivos, proteínas de alto peso molecular, irritantes dérmicos fuertes y materiales que no se adhieren suficientemente al oído durante un tiempo aceptable durante el tratamiento. No existe una uniformidad absoluta en el potencial sensibilizante de una sustancia en ratones, cobayas y humanos.

Las Directrices de la OCDE para el ensayo de productos químicos, directriz n.º 429 del 23 de julio de 2010. ^{[ 3 ]} El método BrdU-ELISA y el método BrdU-FCM se describen en la directriz de ensayo n.º 442B de la OCDE. ^{[ 4 ]}

El Reglamento REACH , Anexo VII, apartado 8.3, establece: «El ensayo de ganglios linfáticos locales en ratones (LLNA) es el método de elección para las pruebas in vivo . Solo en circunstancias excepcionales se deberá utilizar otra prueba. Deberá justificarse el uso de otra prueba».

Según la directriz europea OECD 406 sobre sensibilización cutánea, la prueba LLNA o la prueba MEST ( prueba de hinchazón de la oreja del ratón ) pueden utilizarse como primera etapa en la evaluación del potencial de sensibilización cutánea. Si se observa un resultado positivo en cualquiera de las dos pruebas, la sustancia de prueba puede considerarse un posible sensibilizante y no sería necesario realizar una prueba adicional en cobayas. Sin embargo, si se observa un resultado negativo en la prueba LLNA o MEST, debe realizarse una prueba en cobayas (preferiblemente una GPMT o BT).