Microscopio electrónico de bajo voltaje

Una reducción sustancial de la energía de los electrones permite una mejora significativa del contraste de los elementos ligeros. Las imágenes comparativas que se muestran a continuación demuestran que disminuir el voltaje de aceleración de 80 kV a 5 kV mejora notablemente el contraste de las muestras de prueba. Esta mejora del contraste es consecuencia directa del aumento de la dispersión de electrones asociado a la reducción del voltaje de aceleración.

LVEM proporciona una mejora del contraste de imagen casi veinte veces mayor que la de 100 kV. Esto es muy prometedor para muestras biológicas que están compuestas de elementos ligeros y no presentan suficiente contraste en los TEM clásicos. ^{[ 3 ]}

Además, un recorrido libre medio relativamente bajo (15  nm) para muestras orgánicas a 5 kV significa que, para muestras con espesor constante, se obtendrá un alto contraste a partir de pequeñas variaciones de densidad. Por ejemplo, para un contraste del 5 % en la imagen de campo claro de LVEM, solo necesitamos una diferencia de densidad entre las fases de 0,07 g/cm³ ^. Esto significa que la necesidad habitual de teñir polímeros para mejorar el contraste en el TEM (normalmente con tetróxido de osmio o rutenio ) puede no ser necesaria con la técnica de microscopía electrónica de bajo voltaje. ^{[ 4 ]}

El mayor contraste que se consigue con la microscopía electrónica de bajo voltaje reduce o elimina la necesidad de la tinción tradicional con metales pesados ​​para obtener imágenes de elementos ligeros como el hidrógeno, el carbono, el nitrógeno, el oxígeno, el azufre y el fósforo.

Aunque las tinciones de metales pesados ​​aún pueden utilizarse para aplicaciones que requieren información estructural de alta resolución, la LVEM permite el uso de tinciones alternativas o más suaves, minimizando la posible alteración de la muestra y reduciendo el riesgo de artefactos de imagen. ^{[ 5 ] [ 6 ] [ 7 ]}

Entre los colorantes para metales pesados ​​que no contienen uranilo y las alternativas que se pueden utilizar se incluyen:

• Ácido fosfotúngstico (PTA): se utiliza comúnmente para proteínas, virus y otras macromoléculas biológicas.
• Tetróxido de osmio (OsO ₄ ) – se utiliza a menudo para la fijación y la mejora del contraste de lípidos y membranas.
• Tetróxido de rutenio (RuO ₄ ) – se utiliza para la obtención de imágenes de membranas y polímeros.
• Sales de lantánidos (por ejemplo, samario, cerio): se utilizan como alternativas más seguras en algunos protocolos de tinción de polímeros y productos biológicos.

Si bien la tinción con metales pesados ​​es beneficiosa para experimentos destinados a la determinación de estructuras de alta resolución, resulta altamente indeseable en ciertas preparaciones de muestras de proteínas, ya que podría desestabilizar la muestra debido a su pH ácido y a la concentración relativamente alta de metales pesados. La adición de tinción a muestras seccionadas, como materiales biológicos o polímeros, también puede introducir artefactos en las imágenes. ^{[ 8 ] [ 9 ]}

Los experimentos de LVEM realizados en una muestra de proteína de membrana extraída, analizada con y sin el procedimiento de tinción, muestran una mejora notable en la apariencia de la muestra cuando se omite la tinción estándar. Los resultados indican que la LVEM podría ser incluso más útil que la microscopía electrónica convencional para esta aplicación en particular, ya que evita el paso de tinción, que podría resultar perjudicial, proporcionando así una imagen nítida del estado de agregación de la proteína. ^{[ 10 ] [ 11 ]}

Además, la posibilidad de eliminar el paso de tinción podría contribuir a mejorar la seguridad en el laboratorio, ya que las tinciones comunes de metales pesados, como el acetato de uranilo, conllevan riesgos para la salud.

Los primeros microscopios electrónicos de bajo voltaje eran capaces de resoluciones espaciales de aproximadamente 2,5  nm en TEM, 2,0  nm en STEM y 3,0  nm en SEM. ^{[ 4 ]} La resolución de TEM y STEM se mejoró en los sistemas comerciales hasta 1,0 nm en 2016. Se han reportado resoluciones de TEM de hasta 0,14  nm a 15 keV en 2016 para sistemas no comerciales. ^{[ 12 ]}

Los microscopios electrónicos de bajo voltaje generalmente tienen un tamaño físico menor y requieren menos instalaciones en comparación con los microscopios electrónicos de transmisión de alto voltaje convencionales. Su funcionamiento a voltajes de aceleración más bajos reduce la necesidad de grandes fuentes de alimentación de alto voltaje, infraestructuras de refrigeración complejas y blindaje contra la radiación extenso. Algunos microscopios electrónicos de bajo voltaje emplean sistemas de lentes refrigerados por aire que incorporan imanes permanentes, lo que elimina la necesidad de refrigeración por agua y reduce la complejidad general del sistema. Como resultado, muchos sistemas LVEM pueden instalarse en entornos de laboratorio estándar sin salas de microscopio dedicadas, refrigeración con nitrógeno líquido ni servicios especializados. Estas características simplifican la instalación y el funcionamiento, y facilitan el uso de la microscopía electrónica de transmisión en laboratorios con espacio o infraestructura limitados ^{[ 13 ].}

La menor complejidad y los menores requisitos de infraestructura de los microscopios electrónicos de bajo voltaje mejoran la accesibilidad a la microscopía electrónica de transmisión en una gama más amplia de entornos de investigación y educación. Los voltajes de operación más bajos, la instalación simplificada y la menor dependencia de instalaciones especializadas permiten que los sistemas LVEM se implementen en instituciones que pueden carecer de los recursos necesarios para los laboratorios TEM convencionales de alto voltaje. Esto ha permitido una mayor adopción de la microscopía electrónica de transmisión en entornos de enseñanza, laboratorios de investigación más pequeños e instituciones en regiones con acceso limitado a infraestructura de microscopía avanzada ^{[ 14 ].}