MARCM

El análisis de mosaico con un marcador celular represible , o MARCM , es una técnica genética para crear células homocigotas marcadas individualmente en una Drosophila melanogaster que de otro modo sería heterocigota . ^{[ 1 ]} Ha sido una herramienta crucial en el estudio del desarrollo del sistema nervioso de Drosophila . Esta técnica se basa en la recombinación durante la mitosis mediada por la recombinación FLP-FRT . Como una copia de un gen, proporcionada por el cromosoma equilibrador , suele ser suficiente para rescatar un fenotipo mutante , los clones MARCM pueden usarse para estudiar un fenotipo mutante en un animal que de otro modo sería de tipo silvestre .

Para marcar pequeñas poblaciones de células de un progenitor común , MARCM utiliza el sistema GAL4-UAS . Un gen marcador como GFP se coloca bajo el control de un promotor UAS . GAL4 se expresa de forma ubicua en estas moscas, impulsando así la expresión del marcador. Además, GAL80 está impulsado por un promotor fuerte como tubP. Gal80 es un inhibidor de GAL4 y suprimirá la expresión de GFP en condiciones normales. Este elemento tubP-GAL80 se coloca distal a un sitio FRT. Un segundo sitio FRT se coloca en trans al sitio GAL80, generalmente con un gen o mutación de interés distal a él. Finalmente, la recombinasa FLP está impulsada por un promotor inducible como el choque térmico.

Cuando se induce la transcripción de FLP, se recombinan los cromosomas en los dos sitios FRT de las células en mitosis. Estas células se dividen en dos células hijas homocigotas: una que porta ambos elementos GAL80 y otra que no los porta. La célula hija que carece de GAL80 se marca debido a la expresión del marcador mediante el sistema GAL4-UAS. Todas las células hijas subsiguientes de este progenitor también expresarán el marcador.

Los laboratorios suelen tener líneas preparadas para MARCM que poseen el gen inducible FLP, GAL80 distal a un sitio FRT, GAL4 y el marcador UAS. Estas se pueden cruzar fácilmente con moscas que presenten una mutación de interés distal a un sitio FRT. ^{[ 2 ]}

Aprovechando MARCM, se puede rastrear fácilmente todas las células que se han generado a partir de un único progenitor. Esta es una herramienta útil para el seguimiento del desarrollo y los linajes celulares específicos en diversas condiciones ambientales. Las aplicaciones de MARCM incluyen el estudio de circuitos neuronales , ^{[ 3 ]} análisis clonal, ^{[ 4 ]} cribados genéticos , ^{[ 5 ]} espermatogénesis , ^{[ 6 ]} desarrollo del cono de crecimiento , ^{[ 7 ]} neurogénesis , ^{[ 8 ]} y metástasis tumoral . ^{[ 9 ]}

Muchos avances en la comprensión del desarrollo de Drosophila se han logrado a través de MARCM. El desarrollo, los linajes y las caracterizaciones de los tractos de axones secundarios, ^{[ 10 ]} los mapas anatómicos de las neuronas colinérgicas en los sistemas visuales, ^{[ 11 ]} los linajes que dan lugar a un andamiaje de hemineurómero torácico y el marco de desarrollo para la arquitectura del SNC, ^{[ 12 ]} el papel de Delta en la programación del desarrollo en el cordón nervioso ventral, ^{[ 13 ]} las células octopaminérgicas promotoras de la vigilia en el protocerebro medial , ^{[ 14 ]} los genes involucrados en la morfogénesis neuronal de los cuerpos de hongo , ^{[ 15 ]} y la regulación de la guía axonal comisural ^{[ 16 ]} se han identificado a través de técnicas MARCM.

Existen muchas variantes de MARCM. El MARCM de doble punto permite el marcaje de clones hermanos con dos marcadores separados, lo que permite una mayor resolución del rastreo de linaje. ^{[ 17 ]} En el MARCM inverso, la mutación de interés se coloca en el mismo cromosoma que GAL80, de modo que los clones homocigotos de tipo silvestre se marcarán. ^{[ 18 ]} El MARCM Flip-Out resalta células individuales dentro de clones mutantes (ref "Drosophila Dscam is required for divergent segregation of sister branches and suppresses ectopic bifurcation of axons," Neuron, 2002). El sistema Q permite el MARCM independiente de GAL4 mediante el uso del sistema QF/QS. ^{[ 19 ]} El Q-MARCM también se puede combinar con el MARCM convencional en el MARCM acoplado, lo que permite que las dos progenies de una sola división celular se marquen diferencialmente y se manipulen de forma independiente. ^{[ 19 ]} El MARCM letal permite la generación de grandes poblaciones homocigotas marcadas mediante la inclusión de una mutación letal cerca del sitio GAL80. ^{[ 20 ]} El MARCM de control de doble expresión utiliza el sistema transcripcional LexA-VP16 en concordancia con GAL4-UAS. ^{[ 21 ]} El MARCM también se utiliza a menudo como un cribado genético. ^{[ 15 ]}

• Mosaico (genética)