Meganucleasa

Las meganucleasas son endodesoxirribonucleasas caracterizadas por un sitio de reconocimiento grande (secuencias de ADN de doble cadena de 12 a 40 pares de bases); como resultado, este sitio generalmente aparece solo una vez en cualquier genoma . Por ejemplo, la secuencia de 18 pares de bases reconocida por la meganucleasa I-SceI requeriría, en promedio, un genoma veinte veces mayor que el genoma humano para ser encontrada por casualidad (aunque las secuencias con una sola discrepancia aparecen aproximadamente tres veces por genoma humano). Por lo tanto, las meganucleasas se consideran las enzimas de restricción naturales más específicas .

Entre las meganucleasas, la familia LAGLIDADG de endonucleasas homing se ha convertido en una valiosa herramienta para el estudio de genomas e ingeniería genómica en los últimos quince años. Las meganucleasas son "tijeras moleculares de ADN " que permiten reemplazar, eliminar o modificar secuencias de forma altamente selectiva. Al modificar su secuencia de reconocimiento mediante ingeniería de proteínas, se puede alterar la secuencia objetivo. Las meganucleasas se utilizan para modificar todo tipo de genomas, ya sean bacterianos, vegetales o animales. Abren un amplio abanico de posibilidades para la innovación, especialmente en el campo de la salud humana, por ejemplo, en la eliminación de material genético viral o en la reparación de genes dañados mediante terapia génica.

Las meganucleasas se encuentran en un gran número de organismos: arqueas o arqueobacterias, bacterias, fagos , hongos, levaduras , algas y algunas plantas. Pueden expresarse en diferentes compartimentos celulares: el núcleo , las mitocondrias o los cloroplastos . Se han identificado varios cientos de estas enzimas .

Las meganucleasas están representadas principalmente por dos familias de enzimas principales, conocidas colectivamente como endonucleasas de homing: las endonucleasas de intrón y las endonucleasas de inteína.

En la naturaleza, estas proteínas están codificadas por elementos genéticos móviles, intrones o inteínas . Los intrones se propagan interviniendo en una ubicación precisa del ADN, donde la expresión de la meganucleasa produce una ruptura en el alelo complementario libre de intrones o inteínas . En el caso de las inteínas y los intrones del grupo I, esta ruptura conlleva la duplicación del intrón o la inteína en el sitio de corte mediante la reparación por recombinación homóloga de las rupturas de ADN de doble cadena.

Sabemos relativamente poco sobre la función real de las meganucleasas. Se cree que el material genético que las codifica funciona como un elemento parásito que aprovecha los mecanismos de reparación del ADN de doble cadena para multiplicarse y propagarse sin dañar el material genético del huésped.

Existen cinco familias o clases de endonucleasas de homing. ^{[ 1 ]} La más extendida y conocida es la familia LAGLIDADG . Las endonucleasas de la familia LAGLIDADG se encuentran principalmente en las mitocondrias y los cloroplastos de organismos eucariotas unicelulares.

El nombre de esta familia corresponde a una secuencia de aminoácidos (o motivo) que se encuentra, más o menos conservada, en todas las proteínas de esta familia. Estas pequeñas proteínas también se caracterizan por sus estructuras tridimensionales compactas y densamente empaquetadas.

Las endonucleasas mejor caracterizadas y más utilizadas en la investigación y la ingeniería genómica incluyen I-SceI (descubierta en las mitocondrias de la levadura de panadería Saccharomyces cerevisiae ), I-CreI (de los cloroplastos del alga verde Chlamydomonas reinhardtii ) e I-DmoI (de la arqueobacteria Desulfurococcus mobilis ).

Las endonucleasas LAGLIDADG más conocidas son los homodímeros (por ejemplo, I-CreI, compuesto por dos copias del mismo dominio proteico ) o los monómeros con simetría interna (I-SceI). El sitio de unión al ADN, que contiene el dominio catalítico , está compuesto por dos partes a cada lado del punto de corte. Los sitios de unión parciales pueden ser extremadamente similares y unirse a una secuencia de ADN palindrómica o semipalindrómica (I-CreI), o bien pueden no ser palindrómicos (I-SceI).

The high specificity of meganucleases gives them a high degree of precision and much lower cell toxicity than other naturally occurring restriction enzymes. Meganucleases were identified in the 1990s, and subsequent work has shown that they are particularly promising tools for genome engineering and gene editing, as they are able to efficiently induce homologous recombination,^[2] generate mutations,^[3] and alter reading frames.^[4]

However, the meganuclease-induced genetic recombinations that could be performed were limited by the repertoire of meganucleases available. Despite the existence of hundreds of meganucleases in nature, and the fact that each one is able to tolerate minor variations in its recognition site, the probability of finding a meganuclease able to cut a given gene at the desired location is extremely slim. Several groups turned their attention to engineering new meganucleases that would target the desired recognition sites.

The most advanced research and applications concern homing endonucleases from the LAGLIDADG family.

To create tailor-made meganucleases, two main approaches have been adopted:

• Modifying the specificity of existing meganucleases by introducing a small number of variations to the amino acid sequence and then selecting the functional proteins on variations of the natural recognition site.^[5][6][7]
• A more radical option has been to exploit a property that plays an important role in meganucleases' naturally high degree of diversification: the possibility of associating or fusing protein domains from different enzymes.^[8][9] This option makes it possible to develop chimeric meganucleases with a new recognition site composed of a half-site of meganuclease A and a half-site of protein B. By fusing the protein domains of I-DmoI and I-CreI, two chimeric meganucleases have been created using this method: E-Drel and DmoCre.^[10]

These two approaches can be combined to increase the possibility of creating new enzymes, while maintaining a high degree of efficacy and specificity. The scientists from Cellectis have been working on gene editing since 1999 and have developed a collection of over 20,000 protein domains from the homodimeric meganuclease I-CreI as well as from other meganucleases scaffolds.^[11] They can be combined to form functional chimeric tailor-made heterodimers for research laboratories and for industrial purposes.

Precision Biosciences, otra empresa de biotecnología, ha desarrollado un proceso de diseño totalmente racional llamado Editor de Nucleasa Dirigida (DNE), capaz de crear meganucleasas modificadas que se dirigen a una ubicación definida por el usuario en un genoma y la modifican. ^{[ 12 ]} En 2012, investigadores de Bayer CropScience utilizaron DNE para incorporar una secuencia genética en el ADN de plantas de algodón, dirigiéndola con precisión a un sitio predeterminado. ^{[ 13 ]}

Como se indicó en el párrafo inicial, una meganucleasa con una secuencia de 18 pares de bases requeriría, en promedio, un genoma veinte veces mayor que el genoma humano para ser encontrada por casualidad; el cálculo es ^4¹⁸ / 3 × ^10⁹ = 22,9. Sin embargo, las secuencias muy similares son mucho más comunes, y su frecuencia aumenta rápidamente a medida que se permiten más desajustes.

Por ejemplo, una secuencia idéntica en todos los pares de bases excepto en uno ocurriría por casualidad una vez cada 4 17 / ¹⁸ × 3 × 10 ⁹ ⁠ = 0,32 equivalentes del genoma humano en promedio, o tres veces por genoma humano. Una secuencia idéntica en todos los pares de bases excepto en dos ocurriría por casualidad en promedio una vez cada ^{4 16} / ( 18C2 ) × 3 × 10 ⁹ ⁠ = 0,0094 equivalentes del genoma humano, o 107 veces por genoma humano.

Esto es importante porque las enzimas no discriminan a la perfección; una nucleasa aún tendrá cierta probabilidad de actuar aunque la secuencia no coincida perfectamente. Por lo tanto, la actividad de la nucleasa sobre una secuencia con una sola discrepancia es menor que en el caso de una secuencia sin discrepancias, y la actividad es aún menor para dos discrepancias, aunque sigue sin ser nula. La exclusión de estas secuencias, que son muy similares pero no idénticas, sigue siendo un problema importante que superar en la ingeniería genómica.

La metilación del ADN y la estructura de la cromatina afectan la eficacia de la digestión con meganucleasas. ^{[ 17 ] [ 18 ]} Por lo tanto, es necesario considerar exhaustivamente el contexto genético y epigenético de una secuencia diana para la aplicación práctica de estas enzimas.

En diciembre de 2014, la USPTO emitió la patente 8,921,332 que cubre la edición del genoma basada en meganucleasas in vitro. ^{[ 19 ]} Esta patente fue licenciada exclusivamente a Cellectis. ^{[ 20 ]}

• endonucleasa de homing
• recombinación homóloga
• Yo-creo
• Ingeniería de proteínas
• Diseño de proteínas
• Edición del genoma con nucleasas modificadas
• Ingeniería genómica
• Ingeniería genética

• Celectis
• Biociencias de precisión
• Vídeo explicativo sobre meganucleasas , por Cellectis.