Modelo de bicapa lipídica

Una bicapa lipídica modelo es cualquier bicapa ensamblada in vitro , a diferencia de la bicapa de las membranas celulares naturales o la que recubre diversas estructuras subcelulares como el núcleo . Se utilizan para estudiar las propiedades fundamentales de las membranas biológicas en un entorno simplificado y bien controlado, y cada vez más en biología sintética ascendente para la construcción de células artificiales . ^{[ 1 ]} Una bicapa modelo puede estar hecha con lípidos sintéticos o naturales . Los sistemas modelo más simples contienen solo un lípido sintético puro. Las bicapas modelo más relevantes desde el punto de vista fisiológico pueden hacerse con mezclas de varios lípidos sintéticos o naturales.

Existen diversos tipos de bicapas modelo, cada una con ventajas y desventajas experimentales. El primer sistema desarrollado fue la membrana lipídica negra o bicapa "pintada", que permite una caracterización eléctrica sencilla de las bicapas, pero es efímera y puede resultar difícil de manipular. Las bicapas soportadas se anclan a un sustrato sólido, lo que aumenta su estabilidad y permite el uso de herramientas de caracterización imposibles en solución. Estas ventajas conllevan el inconveniente de interacciones no deseadas con el sustrato, que pueden desnaturalizar las proteínas de la membrana .

El primer sistema de bicapa modelo desarrollado fue la bicapa "pintada", también conocida como "membrana lipídica negra". El término "pintada" se refiere al proceso mediante el cual se fabrican estas bicapas. Primero, se crea una pequeña abertura en una capa delgada de un material hidrofóbico como el teflón . Típicamente, el diámetro de este orificio es de unas pocas decenas de micrómetros hasta cientos de micrómetros. Para formar una BLM, el área alrededor de la abertura se "prepinta" primero con una solución de lípidos disueltos en un solvente hidrofóbico aplicando esta solución a través de la abertura con un pincel, jeringa o aplicador de vidrio. ^{[ 2 ]} El solvente utilizado debe tener un coeficiente de partición muy alto y debe ser relativamente viscoso para evitar la ruptura inmediata. El solvente más común utilizado es una mezcla de decano y escualeno .

Tras dejar secar la abertura, se añade una solución salina (fase acuosa) a ambos lados de la cámara. A continuación, la abertura se "pinta" con una solución lipídica (generalmente la misma que se utilizó para el pre-pintado). Se forma espontáneamente una monocapa lipídica en la interfaz entre las fases orgánica y acuosa a cada lado de la gota de lípido/disolvente. Debido a que las paredes de la abertura son hidrofóbicas, la solución de lípido/disolvente humedece esta interfaz, adelgazando la gota en el centro. Una vez que los dos lados de la gota se acercan lo suficiente, las monocapas lipídicas se fusionan, excluyendo rápidamente el pequeño volumen restante de solución. En este punto, se forma una bicapa en el centro de la abertura, pero permanece un anillo significativo de disolvente en el perímetro. Este anillo es necesario para mantener la estabilidad, ya que actúa como puente entre la  bicapa de ~5 nm y la lámina de decenas de micrómetros de espesor en la que se forma la abertura. ^{[ 3 ]}

El término bicapa "negra" se refiere al hecho de que son oscuras en la luz reflejada porque el grosor de la membrana es de solo unos pocos nanómetros, por lo que la luz que se refleja en la cara posterior interfiere destructivamente con la luz que se refleja en la cara frontal. De hecho, esta fue una de las primeras pistas de que esta técnica producía una membrana de grosor a escala molecular. ^{[ 4 ]} Las membranas lipídicas negras también son muy adecuadas para la caracterización eléctrica porque las dos cámaras separadas por la bicapa son accesibles, lo que permite la colocación sencilla de electrodos grandes. Por esta razón, la caracterización eléctrica es uno de los métodos más importantes utilizados junto con las bicapas lipídicas pintadas. Mediciones sencillas indican cuándo se forma una bicapa y cuándo se rompe, ya que una bicapa intacta tiene una gran resistencia (>GΩ) y una gran capacitancia (~2 μF/cm ² ). La caracterización eléctrica más avanzada ha sido particularmente importante en el estudio de los canales iónicos dependientes de voltaje . Las proteínas de membrana, como los canales iónicos, normalmente no se pueden incorporar directamente a la bicapa pintada durante la formación porque la inmersión en un disolvente orgánico desnaturalizaría la proteína. En cambio, la proteína se solubiliza con un detergente y se añade a la solución acuosa después de que se forma la bicapa. El recubrimiento de detergente permite que estas proteínas se inserten espontáneamente en la bicapa durante un período de minutos. Además, se han realizado experimentos iniciales que combinan investigaciones electrofisiológicas y estructurales de membranas lipídicas negras. ^{[ 5 ]} En otra variación de la técnica BLM, denominada punzón de bicapa,  se utiliza una pipeta de vidrio (diámetro interno ~10-40 μm) como electrodo en un lado de la bicapa para aislar un pequeño parche de membrana. ^{[ 6 ] [ 7 ]} Esta modificación de la técnica de patch clamp permite el registro de bajo ruido, incluso a potenciales altos (hasta 600 mV), a costa de un tiempo de preparación adicional.

Los principales problemas asociados con las bicapas pintadas son el disolvente residual y la vida útil limitada. Algunos investigadores creen que las bolsas de disolvente atrapadas entre las dos capas de la bicapa pueden alterar la función normal de la proteína. Para superar esta limitación, Montal y Mueller desarrollaron una técnica de deposición modificada que elimina el uso de un disolvente pesado no volátil. En este método, la abertura comienza por encima de la superficie del agua, separando completamente las dos cámaras de fluido. En la superficie de cada cámara, se forma una monocapa aplicando lípidos en un disolvente volátil como el cloroformo y esperando a que el disolvente se evapore. Luego, la abertura se baja a través de la interfaz aire-agua y las dos monocapas de las cámaras separadas se pliegan una contra la otra, formando una bicapa a través de la abertura. ^{[ 8 ]} El problema de la estabilidad ha resultado más difícil de resolver. Por lo general, una membrana lipídica negra sobrevive menos de una hora, lo que impide experimentos a largo plazo . Esta vida útil se puede extender estructurando con precisión la abertura de soporte, ^{[ 9 ]} reticulando químicamente los lípidos o gelificando la solución circundante para soportar mecánicamente la bicapa. ^{[ 10 ]} Se está trabajando en esta área y será posible alcanzar vidas útiles de varias horas.

A diferencia de una vesícula o una membrana celular, donde la bicapa lipídica se enrolla formando una envoltura cerrada, una bicapa soportada es una estructura plana que descansa sobre un soporte sólido. Debido a esto, solo la cara superior de la bicapa está expuesta a la solución libre. Esta disposición tiene ventajas e inconvenientes relacionados con el estudio de las bicapas lipídicas. Una de las mayores ventajas de la bicapa soportada es su estabilidad. Las SLB se mantienen prácticamente intactas incluso cuando se someten a altas velocidades de flujo o vibraciones y, a diferencia de las membranas lipídicas negras, la presencia de agujeros no destruye toda la bicapa. Debido a esta estabilidad, es posible realizar experimentos de semanas e incluso meses con bicapas soportadas, mientras que los experimentos con BLM generalmente se limitan a horas. ^{[ 11 ]} Otra ventaja de la bicapa soportada es que, al estar sobre una superficie plana y dura, es susceptible a una serie de herramientas de caracterización que serían imposibles o ofrecerían una menor resolución si se realizaran en una muestra flotando libremente.

Uno de los ejemplos más claros de esta ventaja es el uso de técnicas de sondeo mecánico que requieren una interacción física directa con la muestra. La microscopía de fuerza atómica (AFM) se ha utilizado para obtener imágenes de la separación de fases lipídicas , ^{[ 12 ]} la formación de nanoporos transmembrana seguida de la adsorción de moléculas proteicas individuales, ^{[ 13 ]} y el ensamblaje de proteínas ^{[ 14 ]} con una precisión subnanométrica sin necesidad de un colorante de marcaje. Más recientemente, la AFM también se ha utilizado para sondear directamente las propiedades mecánicas de bicapas individuales ^{[ 15 ]} y para realizar espectroscopia de fuerza en proteínas de membrana individuales. ^{[ 16 ]} Estos estudios serían difíciles o imposibles sin el uso de bicapas soportadas, ya que la superficie de una célula o vesícula es relativamente blanda y se desplazaría y fluctuaría con el tiempo. Otro ejemplo de una sonda física es el uso de la microbalanza de cristal de cuarzo (QCM) para estudiar la cinética de unión en la superficie de la bicapa. ^{[ 17 ]} La interferometría de polarización dual es una herramienta óptica de alta resolución para caracterizar el orden y la disrupción en bicapas lipídicas durante interacciones o transiciones de fase, proporcionando datos complementarios a las mediciones de QCM. ^{[ 18 ]}

Muchas técnicas modernas de microscopía de fluorescencia también requieren una superficie plana rígidamente soportada. Los métodos de campo evanescente , como la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) y la resonancia de plasmones superficiales (SPR), pueden ofrecer una medición extremadamente sensible de la unión del analito y las propiedades ópticas de la bicapa, pero solo pueden funcionar cuando la muestra está soportada sobre materiales ópticamente funcionales especializados. Otra clase de métodos aplicables solo a bicapas soportadas son aquellos basados ​​en interferencia óptica, como la microscopía de contraste de interferencia de fluorescencia (FLIC) y la microscopía de contraste de interferencia de reflexión (RICM) o la microscopía de dispersión interferométrica (iSCAT). ^{[ 19 ] [ 20 ]} Cuando la bicapa está soportada sobre una superficie reflectante, las variaciones en la intensidad debidas a la interferencia destructiva de esta interfaz se pueden utilizar para calcular con precisión de angstrom la posición de los fluoróforos dentro de la bicapa. ^{[ 21 ]} Tanto las técnicas evanescentes como las de interferencia ofrecen una resolución sublongitudinal en una sola dimensión (z, o vertical). En muchos casos, esta resolución es todo lo que se necesita. Después de todo, las bicapas son muy pequeñas solo en una dimensión. Lateralmente, una bicapa puede extenderse por muchos micrómetros o incluso milímetros. Pero ciertos fenómenos como el reordenamiento de fase dinámico ocurren en bicapas a una escala de longitud lateral submicrométrica. Un enfoque prometedor para estudiar estas estructuras es la microscopía óptica de barrido de campo cercano (NSOM). ^{[ 22 ]} Al igual que la AFM, la NSOM se basa en el barrido de una punta micromecanizada para proporcionar una señal altamente localizada. Pero a diferencia de la AFM, la NSOM utiliza una interacción óptica en lugar de física con la muestra, lo que potencialmente perturba las estructuras delicadas en menor medida.

Otra capacidad importante de las bicapas soportadas es la capacidad de modelar la superficie para producir múltiples regiones aisladas en el mismo sustrato. Este fenómeno se demostró por primera vez utilizando arañazos o "corrales" metálicos para evitar la mezcla entre regiones adyacentes, permitiendo al mismo tiempo la difusión libre dentro de cualquier región. ^{[ 23 ] [ 24 ]} Trabajos posteriores extendieron este concepto integrando la microfluídica para demostrar que se podían formar gradientes de composición estables en bicapas, ^{[ 25 ]} lo que potencialmente permite estudios masivamente paralelos de segregación de fases, unión molecular y respuesta celular a membranas lipídicas artificiales. La utilización creativa del concepto de corral también ha permitido estudios de la reorganización dinámica de proteínas de membrana en la interfaz sináptica . ^{[ 26 ]}

Una de las principales limitaciones de las bicapas soportadas es la posibilidad de interacciones no deseadas con el sustrato. Aunque las bicapas soportadas generalmente no tocan directamente la superficie del sustrato, están separadas por una capa de agua muy delgada. El tamaño y la naturaleza de esta capa dependen del material del sustrato ^{[ 27 ]} y de la especie lipídica, pero generalmente es de aproximadamente 1  nm para lípidos zwitteriónicos soportados sobre sílice , el sistema experimental más común. ^{[ 28 ] [ 29 ]} Debido a que esta capa es tan delgada, existe un acoplamiento hidrodinámico extenso entre la bicapa y el sustrato, lo que resulta en un coeficiente de difusión menor en las bicapas soportadas que en las bicapas libres de la misma composición. ^{[ 30 ]} Un cierto porcentaje de la bicapa soportada también será completamente inmóvil, aunque la naturaleza exacta y la razón de estos sitios "anclados" aún son inciertas. Para bicapas soportadas en fase líquida de alta calidad, la fracción inmóvil suele ser de alrededor del 1-5%. Para cuantificar el coeficiente de difusión y la fracción móvil, los investigadores que estudian bicapas soportadas a menudo informan datos de FRAP .

Las interacciones no deseadas con el sustrato representan un problema mucho mayor al incorporar proteínas de membrana integrales, especialmente aquellas con grandes dominios que sobresalen del núcleo de la bicapa. Debido a que el espacio entre la bicapa y el sustrato es tan delgado, estas proteínas a menudo se desnaturalizan en la superficie del sustrato y, por lo tanto, pierden toda su funcionalidad. ^{[ 31 ]} Un enfoque para sortear este problema es el uso de bicapas ancladas a polímeros. En estos sistemas, la bicapa se apoya en una red laxa de polímeros hidratados o hidrogel que actúa como espaciador y, teóricamente, previene las interacciones desnaturalizantes con el sustrato. ^{[ 32 ]} En la práctica, un porcentaje de las proteínas aún perderá movilidad y funcionalidad, probablemente debido a interacciones con los anclajes de polímero/lípido. ^{[ 30 ]} La investigación en esta área continúa.

El uso de una membrana lipídica bicapa anclada (t-BLM) aumenta aún más la estabilidad de las membranas soportadas al anclar químicamente los lípidos al sustrato sólido. ^{[ 33 ]}

El oro puede utilizarse como sustrato debido a su química inerte y a los tiolípidos para la unión covalente al oro. Los tiolípidos están compuestos por derivados lipídicos, con grupos polares extendidos en sus cabezas mediante espaciadores hidrofílicos que terminan en un grupo tiol o disulfuro que forma un enlace covalente con el oro, formando monocapas autoensambladas (SAM).

La limitación de la movilidad intramembrana de las bicapas lipídicas soportadas puede superarse mediante la introducción de lípidos de anclaje que atraviesan la mitad de la membrana ^{[ 34 ]} con disulfuro de bencilo (DPL) y análogos sintéticos de arqueas que atraviesan la membrana completa con cadenas de fitanólido para estabilizar la estructura y unidades de polietilenglicol como espaciador hidrofílico. La formación de la bicapa se logra mediante la exposición del sustrato de oro recubierto de lípidos a los lípidos de la capa externa, ya sea en una solución de etanol o en liposomas. ^{[ 35 ]}

La ventaja de este enfoque radica en que, debido al espacio hidrofílico de aproximadamente 4  nm, la interacción con el sustrato es mínima y el espacio adicional permite la introducción de canales iónicos proteicos en la bicapa. Además, la capa espaciadora crea un reservorio iónico ^{[ 36 ]} que facilita la medición de la impedancia eléctrica de corriente alterna a través de la bicapa.

Una vesícula es una bicapa lipídica enrollada en una envoltura esférica, que encierra una pequeña cantidad de agua y la separa del agua exterior. Debido a esta similitud fundamental con la membrana celular, las vesículas se han utilizado ampliamente para estudiar las propiedades de las bicapas lipídicas. Otra razón por la que las vesículas se han utilizado con tanta frecuencia es que son relativamente fáciles de crear. Si una muestra de lípido deshidratado se expone al agua, formará vesículas espontáneamente. ^{[ 37 ]} Estas vesículas iniciales suelen ser multilamelares (de muchas paredes) y tienen un amplio rango de tamaños, desde decenas de nanómetros hasta varios micrómetros. ^{[ 38 ]} Se necesitan métodos como la sonicación o la extrusión a través de una membrana para romper estas vesículas iniciales en vesículas más pequeñas de pared simple y diámetro uniforme, conocidas como vesículas unilamelares pequeñas (SUV). Las SUV suelen tener diámetros entre 50 y 200  nm. ^{[ 39 ]} Como alternativa, en lugar de sintetizar vesículas, es posible aislarlas simplemente de cultivos celulares o muestras de tejido. ^{[ 40 ]} Las vesículas se utilizan para transportar lípidos, proteínas y muchas otras moléculas dentro de la célula, así como hacia dentro o hacia fuera de ella. Estas vesículas aisladas de forma natural están compuestas por una mezcla compleja de diferentes lípidos y proteínas, por lo que, si bien ofrecen mayor realismo para el estudio de fenómenos biológicos específicos, se prefieren las vesículas artificiales simples para el estudio de las propiedades fundamentales de los lípidos.

Dado que las SUV artificiales se pueden fabricar en grandes cantidades, son adecuadas para estudios de materiales a granel, como la difracción de rayos X para determinar el espaciado de la red ^{[ 41 ]} y la calorimetría diferencial de barrido para determinar las transiciones de fase ^{[ 42 ]} . La interferometría de polarización dual puede medir estructuras unilamelares y multilamelares, así como la inserción y la disrupción de las vesículas en un formato de ensayo sin marcadores ^{[ 43 ]} . Las vesículas también se pueden marcar con colorantes fluorescentes para permitir ensayos de fusión sensibles basados ​​en FRET ^{[ 44 ]} .

A pesar del marcaje fluorescente, a menudo es difícil realizar imágenes detalladas de SUV simplemente porque son muy pequeñas. Para combatir este problema, los investigadores utilizan vesículas unilamelares gigantes (GUV). Las GUV son lo suficientemente grandes (1-200  μm) para ser estudiadas mediante microscopía de fluorescencia tradicional y se encuentran dentro del mismo rango de tamaño que la mayoría de las células biológicas. Por lo tanto, se utilizan como imitaciones de membranas celulares para estudios in vitro en biología molecular y celular. Muchos de los estudios de balsas lipídicas en sistemas lipídicos artificiales se han realizado con GUV por esta razón. ^{[ 45 ]} En comparación con las bicapas soportadas, las GUV presentan un entorno más "natural" ya que no hay una superficie rígida que pueda inducir defectos, afectar las propiedades de la membrana o desnaturalizar proteínas. Por lo tanto, las GUV se utilizan frecuentemente para estudiar la remodelación de membranas y otras interacciones proteína-membrana in vitro. Existen diversos métodos para encapsular proteínas u otros reactivos biológicos dentro de dichas vesículas, lo que convierte a las GUV en un sistema ideal para la recreación (e investigación) in vitro de funciones celulares en entornos de membrana modelo similares a las células. ^{[ 46 ]} Estos métodos incluyen métodos microfluídicos, que permiten una producción de alto rendimiento de vesículas con tamaños uniformes. ^{[ 47 ]}

Las bicapas de interfaz de gotas (DIB) son gotas recubiertas de fosfolípidos que forman bicapas al ponerse en contacto. ^{[ 48 ] [ 49 ]} Las gotas están rodeadas de aceite y los fosfolípidos se dispersan en el agua o en el aceite. ^{[ 48 ]} Como resultado, los fosfolípidos forman espontáneamente una monocapa en cada una de las interfaces aceite-agua. ^{[ 48 ]} Las DIB se pueden formar para crear material similar a un tejido con la capacidad de formar bicapas asimétricas, reconstituir proteínas y canales proteicos o para su uso en el estudio de la electrofisiología. ^{[ 50 ] [ 51 ] [ 52 ] [ 53 ] [ 54 ]} Se pueden formar redes extendidas de DIB empleando dispositivos microfluídicos de gotas o utilizando impresoras de gotas. ^{[ 54 ] [ 55 ]}

Las micelas de detergente ^{[ 56 ]} son ​​otra clase de membranas modelo que se utilizan comúnmente para purificar y estudiar proteínas de membrana , aunque carecen de una bicapa lipídica. En soluciones acuosas, las micelas son agregados de moléculas anfipáticas con sus cabezas hidrofílicas expuestas al disolvente y sus colas hidrofóbicas en el centro. Las micelas pueden solubilizar proteínas de membrana encapsulándolas parcialmente y protegiendo sus superficies hidrofóbicas del disolvente.

Las bicelas son una clase relacionada de membranas modelo, ^{[ 57 ]} generalmente formadas por dos lípidos, uno de los cuales forma una bicapa lipídica mientras que el otro forma una estructura anfipática similar a una micela que protege el centro de la bicapa de las moléculas de disolvente circundantes. Las bicelas pueden considerarse como un segmento de bicapa encapsulado y solubilizado por una micela. Las bicelas son mucho más pequeñas que los liposomas, por lo que pueden utilizarse en experimentos como la espectroscopia de RMN, donde las vesículas de mayor tamaño no son una opción.

Los nanodiscos ^{[ 58 ]} consisten en un segmento de bicapa encapsulado por una capa de proteína anfipática, en lugar de una capa lipídica o detergente. Los nanodiscos son más estables que las bicelas y micelas a bajas concentraciones, y su tamaño está muy bien definido (dependiendo del tipo de capa de proteína, entre 10 y 20 nm ). Las proteínas de membrana incorporadas y solubilizadas por los nanodiscos pueden estudiarse mediante una amplia variedad de técnicas biofísicas. ^{[ 59 ] [ 60 ]}