Fosfolipasa D específica de N-acilfosfatidiletanolamina

La N-acilfosfatidiletanolamina fosfolipasa D ( NAPE-PLD ) es una enzima que cataliza la liberación de N-aciletanolamina (NAE) a partir de N-acilfosfatidiletanolamina (NAPE). Este es un componente fundamental del proceso que convierte los lípidos comunes en señales químicas como la anandamida y la oleoiletanolamina . En humanos, la proteína NAPE-PLD está codificada por el gen NAPEPLD . ^{[ 5 ] [ 6 ] [ 7 ] [ 8 ]}

NAPE-PLD es una actividad enzimática , una fosfolipasa , que actúa sobre los fosfolípidos presentes en la membrana celular . No es la homología , sino el resultado químico de su actividad lo que la clasifica como fosfolipasa D. La actividad enzimática fue descubierta y caracterizada en una serie de experimentos que culminaron en la publicación en 2004 de un esquema de purificación bioquímica a partir del cual se pudo realizar la secuenciación de péptidos . ^{[ 6 ]} Los investigadores homogeneizaron (molieron finamente) corazones de 150 ratas y sometieron el lisado crudo resultante a sedimentación con sacarosa a 105 000 xg para separar las membranas celulares del resto de la célula. Las proteínas de membrana integrales se solubilizaron luego utilizando octil glucósido y se sometieron a cuatro pasos de cromatografía en columna (columna de intercambio catiónico HiTrap SP HP, columna de intercambio aniónico HiTrap Q, columna de afinidad HiTrap Blue, columna de hidroxiapatita Bio-Gel HTP). Cada uno de estos sistemas separa los distintos tipos de proteínas de membrana en diferentes recipientes de muestra a medida que las proteínas se eluyen de la columna con el tiempo, y al medir la actividad de las muestras en cada recipiente fue posible rastrear cuáles recibieron la enzima activa. La medición de la actividad enzimática se realizó mediante cromatografía de capa fina de un sustrato radiactivo sensible a la actividad enzimática de NAPE-PLD: la escisión del sustrato afectó su posición en la placa cuando se detectó la radiación en un analizador de bioimágenes.

El resultado de este extenso procedimiento aún no era una proteína pura, pero produjo un número limitado de bandas por SDS-PAGE , y se encontró que una banda de 46 kilodaltons se correlacionaba en intensidad con la actividad enzimática. Esta banda se cortó del gel y se digirió con tripsina , y los péptidos de ella se separaron entre sí por cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa . Los fragmentos resultantes luego se microsecuenciaron por una degradación de Edman automatizada . ^{[ 9 ]} Tres correspondían a vimentina , una proteína de filamento intermedio de 56 kDa que se creía que era un contaminante, y los otros dos coincidían con el clon de ADNc posteriormente identificado como NAPE-PLD.

Una vez obtenida esta pista, la identificación pudo confirmarse mediante un procedimiento menos engorroso: la sobreexpresión del supuesto ADNc de NAPE-PLD en células COS-7 produjo una fuerte actividad enzimática de NAPE-PLD, cuyas características resultaron ser similares a las del extracto cardíaco original. ^{[ 6 ]}

La secuencia de ADNc de NAPEPLD predice 396 secuencias de aminoácidos tanto en ratones como en ratas, que son 89% y 90% idénticas a las de los humanos. ^{[ 6 ]} Se encontró que NAPE-PLD no tiene homología con los genes conocidos de fosfolipasa D , pero puede clasificarse por homología para caer en la familia de metalohidrolasas de zinc del pliegue de beta-lactamasa . En particular, se observó el motivo altamente conservado H X( E / H )X D ( C / R / S / H )X _50–70 H X _15–30 ( C / S / D )X _30–70 H , que, en general, está asociado con la unión de zinc y la reacción de hidrólisis en esta clase de proteínas, lo que llevó a los autores a proponer que la actividad debería estar correlacionada con el contenido de zinc.

Cuando se probó la NAPE-PLD recombinante en células COS in vitro, tuvo una actividad similar hacia varios sustratos radiomarcados : N-palmitoilfosfatidiletanolamina, N-araquidonilfosfatidiletanolamina, N-oleoilfosfatidiletanolamina y N-estearoilfosfatidiletanolamina reaccionaron con una K _m entre 2–4 micromolar y una V _max entre 73 y 101 nanomol por miligramo por minuto según lo calculado por el gráfico de Lineweaver–Burk . ^{[ 6 ]} (Estos generan N- palmitoiletanolamina , anandamida , N- oleoiletanolamina y N-estearoiletanolamina, respectivamente) La enzima también reaccionó con N-palmitoil-lisofosfatidiletanolamina y N-araquidonil-lisofosfatidiletanolamina con una K _m similar pero a un tercio a un cuarto de la V _max . Estas actividades concuerdan con la observación de que muchos tejidos producen una variedad de N -aciletanolaminas .

Sin embargo, la NAPE-PLD no tenía la capacidad de producir ácido fosfatídico detectable a partir de fosfatidilcolina o fosfatidiletanolamina , como sí lo hacen otras enzimas fosfolipasa D. También carece de la actividad de transfosfatidilación de la fosfolipasa D, que permite la creación de alcoholes fosfatidílicos en lugar de ácido fosfatídico en presencia de etanol o butanol .

Esta enzima actúa como el segundo paso de una vía bioquímica iniciada por la creación de N-acilfosfatidiletanolamina , mediante la transferencia de un grupo acilo de la posición sn -1 del glicerofosfolípido al grupo amino de la fosfatidiletanolamina . ^{[ 6 ]} Si bien la NAPE-PLD contribuye a la biosíntesis de varios NAE en el sistema nervioso central de los mamíferos , no está claro si esta enzima no es responsable de la formación del endocannabinoide anandamida , ya que se ha informado que los ratones knockout de NAPE-PLD tienen niveles de tipo silvestre o niveles muy reducidos de anandamida. ^{[ 10 ]}

Las N-aciletanolaminas liberadas por esta enzima se convierten en sustratos potenciales para la hidrolasa de amida de ácidos grasos (FAAH), que hidroliza los ácidos grasos libres de la etanolamina . Los defectos en esta enzima pueden causar que los productos de la NAPE-PLD, como la anandamida, se acumulen hasta niveles 15 veces superiores a los observados normalmente. ^{[ 11 ]}

Esta enzima de membrana forma homodímeros , parcialmente separados por un canal interno de aproximadamente 9 Å de ancho. ^{[ 12 ]} El plegamiento de la proteína metalo beta-lactamasa está adaptado para asociarse con fosfolípidos de membrana . Una cavidad hidrofóbica proporciona una vía de entrada para el sustrato NAPE al sitio activo, donde un centro de zinc binuclear cataliza su hidrólisis. Los ácidos biliares se unen con alta afinidad a bolsillos selectivos en esta cavidad, lo que mejora el ensamblaje del dímero y permite la catálisis. NAPE-PLD facilita la comunicación cruzada entre las señales de ácidos biliares y las señales de amida lipídica. ^{[ 12 ] [ 13 ] [ 14 ]}

Los diuréticos tiazídicos y similares a las tiazidas se encuentran entre los fármacos más eficaces y utilizados para el tratamiento de la hipertensión , el edema y los principales eventos cardiovasculares . A pesar de más de seis décadas de uso clínico, el mecanismo de acción por el cual estos fármacos curan la hipertensión después de un uso prolongado había permanecido misterioso. Recientemente, Garau Gianpiero y coautores informaron que la enzima de membrana NAPE-PLD es un objetivo renal y extrarrenal de la hidroclorotiazida , la clortalidona y la indapamida , lo que arroja luz sobre su mecanismo de acción en el tratamiento de la hipertensión y las enfermedades cardiovasculares . ^{[ 15 ]} Como revelan las estructuras cristalinas de NAPE-PLD en complejo con hidroclorotiazida y fosfato de piridoxal (PLP), las moléculas de tiazida se unen dentro del canal interno de 9 Angostrom de ancho de NAPE-PLD de una manera competitiva con el cofactor PLP . En presencia de ácidos biliares , la asociación de NAPE-PLD con las membranas crea poros membranosos que actúan como vías conductoras dinámicas a través de las cuales el PLP cargado puede difundirse a través de las membranas celulares y de los compartimentos subcelulares (p. ej., mitocondrias y peroxisomas ). El hecho de que los medicamentos tiazídicos promuevan efectos beneficiosos que involucran directamente a una proteína principal del sistema endocannabinoide , NAPE-PLD, revela no solo una nueva diana para las enfermedades cardiovasculares , sino también una forma de modular eficazmente el sistema endocannabinoide en la terapia. Estos resultados pueden ser útiles en el manejo de los factores de riesgo vascular, así como de la leucoencefalopatía y la enfermedad desmielinizante asociadas .