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Secuenciación masivamente paralela

La secuenciación masivamente paralela ( MPS ) es cualquiera de los diversos enfoques de alto rendimiento para la secuenciación de ADN que utilizan el concepto de procesamiento m...

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La secuenciación masivamente paralela ( MPS ) es cualquiera de los diversos enfoques de alto rendimiento para la secuenciación de ADN que utilizan el concepto de procesamiento masivamente paralelo ; también se denomina secuenciación de próxima generación ( NGS ) o secuenciación de segunda generación . Algunas de estas tecnologías surgieron entre 1993 y 1998 [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ] y han estado disponibles comercialmente desde 2005. Estas tecnologías utilizan plataformas miniaturizadas y paralelas para la secuenciación de 1 millón a 43 mil millones de lecturas cortas (de 50 a 400 bases cada una) por ejecución del instrumento.

Muchas plataformas NGS difieren en sus configuraciones de ingeniería y química de secuenciación. Comparten el paradigma técnico de secuenciación masivamente paralela mediante plantillas de ADN amplificadas clonalmente y separadas espacialmente, o moléculas de ADN individuales en una celda de flujo . Este diseño es muy diferente al de la secuenciación de Sanger —también conocida como secuenciación capilar o secuenciación de primera generación— que se basa en la separación electroforética de los productos de terminación de cadena producidos en reacciones de secuenciación individuales. [ 6 ] Esta metodología permite completar la secuenciación a mayor escala. [ 7 ]

Historia

En la década de 1990, Applied Biosystems dominaba la tecnología de secuenciación de ADN con sus máquinas automatizadas de secuenciación Sanger por electroforesis capilar . Sin embargo, a principios de la década de 2000, muchas empresas nuevas entraron en el mercado, impulsadas por el objetivo de reducir los costos de secuenciación del genoma por debajo de los 1000 dólares tras el entusiasmo generado por el Proyecto Genoma Humano . [ 8 ] Muchos de estos nuevos métodos se desarrollaron inicialmente con el apoyo de los Institutos Nacionales de la Salud (NIH) mediante el programa «Desarrollo Tecnológico para el Genoma de 1000 dólares», [ 9 ] lanzado durante el mandato de Francis Collins como director del Instituto Nacional de Investigación del Genoma Humano . [ 10 ]

Los primeros secuenciadores de nueva generación se basaron en la pirosecuenciación , desarrollada originalmente por Pyrosequencing AB y posteriormente comercializada por 454 Life Sciences . En 2003, 454 Life Sciences lanzó el GS20, el primer secuenciador de ADN NGS. Este sistema proporcionaba lecturas de aproximadamente 400-500 pb de longitud con una precisión del 99 %, lo que permitía secuenciar unos 25 millones de bases en una ejecución de cuatro horas a costes significativamente inferiores en comparación con la secuenciación Sanger. [ 11 ] Las máquinas de secuenciación desarrolladas por 454 representaron un cambio de paradigma al permitir la paralelización masiva de las reacciones de secuenciación, lo que aumentó significativamente la cantidad de ADN secuenciado por ejecución, convirtiendo a 454 Life Sciences en el primer gran éxito en la tecnología NGS comercial. [ 12 ]

También en 2003, Solexa comenzó a desarrollar un método competitivo conocido como Secuenciación por Síntesis (SBS) . En 2004, Solexa adquirió la tecnología de secuenciación de colonias (amplificación en puente) de Manteia , produciendo fragmentos de ADN densamente agrupados ("polonias") inmovilizados en celdas de flujo. Estos densos cúmulos generaron señales fluorescentes más fuertes, mejorando la precisión y reduciendo los costos ópticos. En 2005, Solexa integró una ADN polimerasa modificada y nucleótidos terminadores reversibles, lo que permitió ciclos repetidos de secuenciación e imagen. El primer secuenciador comercial basado en esta tecnología, Genome Analyzer, se lanzó en 2006, proporcionando lecturas más cortas (aproximadamente 35 pb) pero mayor rendimiento (hasta 1 Gbp por ejecución) y capacidad de secuenciación de extremos apareados, en la que se secuencian ambos extremos de un fragmento de ADN. [ 13 ]

En 2007, 454 Life Sciences fue adquirida por Roche [ 14 ] y Solexa por Illumina , [ 15 ] el mismo año en que Applied Biosystems presentó SOLiD , una plataforma de secuenciación basada en ligación . [ 16 ] Sin embargo, SOLiD tuvo problemas para secuenciar regiones palindrómicas [ 17 ] y finalmente se descontinuó. [ 8 ] En 2011, Ion Torrent presentó otra alternativa, que medía los cambios de protones ( pH ) durante la incorporación de nucleótidos utilizando sensores basados ​​en semiconductores . [ 18 ] Los sistemas de Ion Torrent producían rápidamente lecturas de 100 pb, pero frecuentemente tenían dificultades para secuenciar homopolímeros con precisión, [ 19 ] lo que finalmente llevó a su abandono. [ 8 ]

Debido a las limitaciones de los métodos de la competencia, la tecnología SBS de Illumina acabó dominando el mercado de la secuenciación. [ 8 ] Para 2012, las expectativas de que 454 obtendría una participación sustancial en el mercado de la secuenciación no se habían cumplido, y la adquisición de Roche en 2007 se consideraba cada vez más como de bajo rendimiento; ese mismo año, Roche hizo un intento fallido de adquirir Illumina. [ 14 ] En octubre de 2013, Roche anunció que cerraría 454 y dejaría de dar soporte a la plataforma a mediados de 2016. [ 20 ] Para 2014, Illumina controlaba aproximadamente el 70% de las ventas de secuenciadores de ADN y generaba más del 90% de los datos de secuenciación. [ 21 ] [ 22 ] Ese año, Illumina presentó la plataforma HiSeq X Ten, aumentando significativamente el rendimiento y afirmando el objetivo largamente anhelado de secuenciar genomas humanos a unos 1000 dólares cada uno. [ 23 ] Illumina superó este hito en 2017 con el lanzamiento de NovaSeq, un sistema capaz de generar más de 3000 Gbp por ejecución. [ 8 ]

El continuo aumento de la demanda de datos de secuenciación, junto con la expiración en 2023 de varias patentes clave de Illumina, ha impulsado una ola de competidores de secuenciación de lectura corta, cada uno aportando químicas, diseños de celdas de flujo, niveles de rendimiento y estructuras de costos distintos. [ 24 ] A principios de la década de 2020, las plataformas de secuenciación por síntesis de Illumina seguían siendo dominantes; una visión general de 2023 estimó que más del 90 % de los datos de secuenciación del mundo en 2022 se habían generado en instrumentos de Illumina. [ 25 ] Entre los competidores se encontraban MGI Tech , cuyas plataformas DNBSEQ utilizan nanobolas de ADN en lugar de la amplificación de puente al estilo de Illumina, y Ultima Genomics , que desarrolló una plataforma a escala de producción utilizando una celda de flujo de disco giratorio. [ 25 ] Singular Genomics presentó la plataforma de secuenciación G4 a finales de 2021, Element Biosciences le siguió anunciando la secuenciación AVITI en marzo de 2022, y PacBio posteriormente entró en el espacio de lectura corta con su plataforma de sobremesa Onso, presentada en octubre de 2022. [ 26 ]

La serie NovaSeq X de Illumina comenzó a distribuirse en 2023 y utilizaba una celda de flujo rediseñada, una química de secuenciación actualizada y una óptica mejorada. Illumina afirmó que el sistema podía generar hasta tres veces más datos por ejecución que el NovaSeq 6000 anterior y reducir el coste de secuenciar un genoma humano a unos 200 dólares estadounidenses cuando se utilizaba por completo. [ 25 ]

La participación de PacBio en el mercado de lecturas cortas fue efímera: después de lanzar la plataforma de lecturas cortas Onso en 2023, la empresa completó la venta de propiedad intelectual selecta y otros activos relacionados con su tecnología de secuenciación de lecturas cortas a Illumina en enero de 2026. [ 27 ] [ 28 ]

Plataformas NGS

La secuenciación de ADN con plataformas NGS disponibles comercialmente generalmente se lleva a cabo siguiendo estos pasos. Primero, se generan bibliotecas de secuenciación de ADN mediante amplificación clonal por PCR in vitro . Segundo, el ADN se secuencia por síntesis , de modo que la secuencia de ADN se determina mediante la adición de nucleótidos a la cadena complementaria en lugar de mediante química de terminación de cadena. Tercero, las plantillas de ADN amplificadas y separadas espacialmente se secuencian simultáneamente de forma masivamente paralela sin necesidad de una etapa de separación física. Estos pasos se siguen en la mayoría de las plataformas NGS, pero cada una utiliza una estrategia diferente. [ 29 ]

La paralelización de las reacciones de secuenciación mediante NGS genera cientos de megabases a gigabases de lecturas de secuencias de nucleótidos en una sola ejecución del instrumento. Esto ha permitido un aumento drástico en los datos de secuencia disponibles y ha cambiado fundamentalmente los enfoques de secuenciación del genoma en las ciencias biomédicas. [ 30 ] Las nuevas tecnologías e instrumentos NGS emergentes han contribuido aún más a una disminución significativa en el costo de la secuenciación, acercándose a los 500 dólares por secuenciación del genoma en 2022. [ 31 ]

En 2014, las plataformas de secuenciación masivamente paralela ya estaban disponibles comercialmente y sus características se resumen en la tabla. Dado el rápido avance de las tecnologías NGS, las especificaciones técnicas y los precios están sujetos a cambios.

Una máquina de secuenciación Illumina HiSeq 2000

Se indican los tiempos de ejecución y la producción en gigabases (Gb) por ejecución para la secuenciación de extremo único. Los tiempos de ejecución y la producción se duplican aproximadamente al realizar la secuenciación de extremos emparejados. ‡Longitudes de lectura promedio para las plataformas Roche 454 y Helicos Biosciences. [ 43 ]

Métodos de preparación de plantillas para NGS

Para la preparación de plantillas para reacciones de secuenciación de nueva generación (NGS) se utilizan dos métodos: plantillas amplificadas a partir de moléculas de ADN individuales y plantillas de moléculas de ADN individuales. Para sistemas de imagen que no pueden detectar eventos de fluorescencia individuales, se requiere la amplificación de plantillas de ADN. Los tres métodos de amplificación más comunes son la PCR en emulsión (emPCR), la amplificación por círculo rodante y la amplificación en fase sólida. La distribución final de las plantillas puede ser aleatoria o en una cuadrícula.

PCR en emulsión

En los métodos de PCR en emulsión , primero se genera una biblioteca de ADN mediante la fragmentación aleatoria de ADN genómico. Los fragmentos de ADN monocatenario (moldes) se unen a la superficie de microesferas con adaptadores o conectores, y una microesfera se une a un único fragmento de ADN de la biblioteca. La superficie de las microesferas contiene sondas de oligonucleótidos con secuencias complementarias a los adaptadores que se unen a los fragmentos de ADN. A continuación, las microesferas se compartimentan en gotas de emulsión de agua y aceite. En la emulsión acuosa de agua y aceite, cada gota que contiene una microesfera actúa como un microrreactor de PCR que produce copias amplificadas del único molde de ADN. [ 44 ] [ 45 ] [ 46 ]

nanobolas de círculo rodante cuadriculado

La amplificación de una población de moléculas de ADN individuales mediante amplificación por círculo rodante en solución va seguida de la captura en una cuadrícula de puntos cuyo tamaño es menor que el de los ADN que se van a inmovilizar. [ 47 ] [ 48 ] [ 49 ] [ 50 ] Las tecnologías de secuenciación de segunda generación, como DNBSEQ de MGI Tech o AVITI de Element Biosciences, utilizan este enfoque para la preparación de la muestra en la celda de flujo, que luego se visualiza ciclo a ciclo.

Generación de colonias de ADN (amplificación en puente)

Los cebadores directo e inverso se unen covalentemente a alta densidad a la lámina en una celda de flujo. La proporción de cebadores con respecto a la plantilla en el soporte define la densidad superficial de los cúmulos amplificados. La celda de flujo se expone a reactivos para la extensión basada en polimerasa , y el cebado ocurre cuando el extremo libre/distal de un fragmento ligado se une a un oligonucleótido complementario en la superficie. La desnaturalización y extensión repetidas dan como resultado la amplificación localizada de fragmentos de ADN en millones de ubicaciones separadas a lo largo de la superficie de la celda de flujo. La amplificación en fase sólida produce entre 100 y 200 millones de cúmulos de plantilla espacialmente separados, lo que proporciona extremos libres a los que se hibrida un cebador de secuenciación universal para iniciar la reacción de secuenciación. [ 44 ] [ 45 ] Esta tecnología fue patentada en 1997 por el Instituto de Investigación Biomédica de Ginebra (GBRI) de Glaxo-Welcome, por Pascal Mayer , Eric Kawashima y Laurent Farinelli, [ 4 ] [ 5 ] y se presentó públicamente por primera vez en 1998. [ 51 ] En 1994, Chris Adams y Steve Kron presentaron una patente sobre un método de amplificación de superficie similar, pero no clonal, llamado “amplificación de puente” [ 3 ] adaptado para la amplificación clonal en 1997 por Church y Mitra. [ 47 ] [ 48 ]

Plantillas de molécula única

Los protocolos que requieren amplificación de ADN suelen ser engorrosos de implementar y pueden introducir errores de secuenciación. La preparación de plantillas de molécula única es más sencilla y no requiere PCR, que puede introducir errores en las plantillas amplificadas. Las secuencias objetivo ricas en AT y GC suelen mostrar sesgo de amplificación, lo que resulta en su subrepresentación en alineamientos y ensamblajes genómicos. Las plantillas de molécula única generalmente se inmovilizan en soportes sólidos utilizando al menos tres enfoques diferentes. En el primer enfoque, moléculas de cebadores individuales distribuidas espacialmente se unen covalentemente al soporte sólido. La plantilla, que se prepara fragmentando aleatoriamente el material de partida en tamaños pequeños (por ejemplo, ~200–250 pb) y añadiendo adaptadores comunes a los extremos de los fragmentos, se hibrida luego con el cebador inmovilizado. En el segundo enfoque, las plantillas de molécula única distribuidas espacialmente se unen covalentemente al soporte sólido mediante el cebado y la extensión de plantillas de molécula única de cadena simple a partir de cebadores inmovilizados. Luego, un cebador común se hibrida con la plantilla. En ambos enfoques, la ADN polimerasa puede unirse a la plantilla cebada inmovilizada para iniciar la reacción de secuenciación de nueva generación (NGS). Helicos BioSciences utiliza ambos enfoques. En un tercer enfoque, se unen moléculas individuales de polimerasa, distribuidas espacialmente, a un soporte sólido al que se une una molécula plantilla cebada. Pacific Biosciences utiliza este enfoque. Con esta técnica se pueden utilizar moléculas de ADN más grandes (hasta decenas de miles de pares de bases) y, a diferencia de los dos primeros enfoques, el tercero se puede utilizar con métodos en tiempo real, lo que permite obtener lecturas potencialmente más largas.

Enfoques de secuenciación

Secuenciación por síntesis

El objetivo de la secuenciación por síntesis (SBS) es determinar la secuencia de una muestra de ADN detectando la incorporación de un nucleótido por una ADN polimerasa . Se utiliza una polimerasa modificada para sintetizar una copia de una sola hebra de ADN y se monitoriza la incorporación de cada nucleótido. El principio de la secuenciación por síntesis se describió por primera vez en 1993 [ 1 ] , con mejoras publicadas algunos años después [ 52 ] . Las partes clave son muy similares para todas las modalidades de SBS e incluyen: (1) amplificación del ADN para mejorar la señal subsiguiente y fijar el ADN a secuenciar a un soporte sólido; (2) generación de ADN monocatenario en el soporte sólido; (3) incorporación de nucleótidos mediante una polimerasa modificada; y (4) detección de la incorporación del nucleótido. Luego se repiten los pasos 3 y 4, y la secuencia se ensambla a partir de las señales obtenidas en el paso 4. Este principio de secuenciación por síntesis se ha utilizado para casi todos los instrumentos de secuenciación masivamente paralela, incluidos 454 , PacBio , IonTorrent , Illumina y MGI .

pirosecuenciación

El principio de la pirosecuenciación se describió por primera vez en 1993 [ 1 ] combinando un soporte sólido con una ADN polimerasa modificada genéticamente que carecía de actividad exonucleasa 3´ a 5´ (corrección de pruebas) y detección luminiscente en tiempo real utilizando la luciferasa de luciérnaga . Se introdujeron todos los conceptos clave de la secuenciación por síntesis, incluyendo (1) amplificación del ADN para mejorar la señal subsiguiente y unir el ADN a secuenciar (plantilla) a un soporte sólido, (2) generación de ADN monocatenario en el soporte sólido, (3) incorporación de nucleótidos utilizando una polimerasa modificada genéticamente y (4) detección del nucleótido incorporado mediante detección de luz en tiempo real. En un artículo de seguimiento, [ 2 ] el concepto se desarrolló aún más y en 1998, se publicó un artículo [ 52 ] en el que los autores demostraron que los nucleótidos no incorporados podían eliminarse con una cuarta enzima ( apirasa ) lo que permitía realizar la secuenciación por síntesis sin necesidad de lavar los nucleótidos no incorporados.

Secuenciación mediante química de terminadores reversibles

Este enfoque utiliza dNTPs unidos a terminadores reversibles en un método cíclico que comprende la incorporación de nucleótidos, la obtención de imágenes de fluorescencia y la escisión. Un terminador marcado con fluorescencia se visualiza a medida que se agrega cada dNTP y luego se escinde para permitir la incorporación de la siguiente base. Estos nucleótidos están bloqueados químicamente de manera que cada incorporación es un evento único. Un paso de obtención de imágenes sigue a cada paso de incorporación de base, luego el grupo bloqueado se elimina químicamente para preparar cada hebra para la siguiente incorporación por la ADN polimerasa. Esta serie de pasos continúa durante un número específico de ciclos, según lo determinado por la configuración del instrumento definida por el usuario. Los grupos de bloqueo 3' fueron concebidos originalmente como una reversión enzimática [ 53 ] o química [ 34 ] [ 35 ]. El método químico ha sido la base de las máquinas Solexa e Illumina. La secuenciación por química de terminadores reversibles puede ser un ciclo de cuatro colores como el utilizado por Illumina/Solexa, o un ciclo de un color como el utilizado por Helicos BioSciences. Helicos BioSciences utilizó “terminadores virtuales”, que son terminadores desbloqueados con un segundo análogo de nucleósido que actúa como inhibidor. Estos terminadores tienen las modificaciones adecuadas para grupos terminadores o inhibidores, de modo que la síntesis de ADN se detiene tras la adición de una sola base. [ 45 ] [ 54 ] [ 55 ]

Secuenciación por ligación mediada por enzimas ligasas

En este enfoque, la reacción de extensión de secuencia no la llevan a cabo las polimerasas, sino la ADN ligasa y sondas codificadas de una o dos bases. En su forma más simple, una sonda marcada con fluorescencia se hibrida con su secuencia complementaria adyacente a la plantilla cebada. A continuación, se añade ADN ligasa para unir la sonda marcada con el colorante al cebador. Las sondas no ligadas se eliminan mediante lavado, seguido de imágenes de fluorescencia para determinar la identidad de la sonda ligada. El ciclo puede repetirse utilizando sondas escindibles para eliminar el colorante fluorescente y regenerar un grupo 5′-PO4 para ciclos de ligación posteriores (ligación en cadena [ 36 ] [ 56 ] ) o eliminando e hibridando un nuevo cebador a la plantilla (ligación no en cadena [ 38 ] [ 39 ] ).

Nucleótidos fluorescentes fosforilados o secuenciación en tiempo real

Pacific Biosciences lidera actualmente este método. El método de secuenciación en tiempo real implica la visualización de la incorporación continua de nucleótidos marcados con colorante durante la síntesis de ADN: moléculas individuales de ADN polimerasa se adhieren a la superficie inferior de detectores de guía de onda de modo cero (detectores Zmw) individuales que pueden obtener información de secuencia mientras los nucleótidos fosfoenlazados se incorporan a la cadena de cebador en crecimiento. Pacific Biosciences utiliza una ADN polimerasa única que incorpora mejor los nucleótidos fosfoenlazados y permite la resecuenciación de plantillas circulares cerradas. Si bien la precisión de lectura única es del 87 %, se ha demostrado una precisión de consenso del 99,999 % con longitudes de lectura de varios kilobases. [ 57 ] [ 58 ] En 2015, Pacific Biosciences lanzó un nuevo instrumento de secuenciación llamado Sequel System, que aumenta la capacidad aproximadamente 6,5 veces. [ 59 ] [ 60 ]

Véase también

Referencias

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