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espectroscopia de resonancia magnética nuclear

Un instrumento de RMN de 900 MHz con un imán de 21,1 T en HWB-NMR , Birmingham, Reino Unido. La espectroscopia de resonancia magnética nuclear , comúnmente conocida como esp...

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Un  instrumento de RMN de 900 MHz con un imán de 21,1 T en HWB-NMR , Birmingham, Reino Unido. 

La espectroscopia de resonancia magnética nuclear , comúnmente conocida como espectroscopia RMN o espectroscopia de resonancia magnética ( ERM ), es una técnica espectroscópica basada en la reorientación de núcleos atómicos con espines nucleares distintos de cero en un campo magnético externo. Esta reorientación se produce por la absorción de radiación electromagnética en la región de radiofrecuencia de aproximadamente 4 a 900  MHz, que depende de la naturaleza isotópica del núcleo y aumenta proporcionalmente a la intensidad del campo magnético externo. [ 1 ] Cabe destacar que la frecuencia de resonancia de cada núcleo activo en RMN depende de su entorno químico. Como resultado, los espectros de RMN proporcionan información sobre los grupos funcionales individuales presentes en la muestra, así como sobre las conexiones entre núcleos cercanos en la misma molécula. Dado que los espectros de RMN son únicos o altamente característicos de compuestos y grupos funcionales individuales , la espectroscopia de RMN es uno de los métodos más importantes para identificar estructuras moleculares, particularmente de compuestos orgánicos .

El principio de la RMN generalmente implica tres pasos secuenciales:

  1. La alineación (polarización) de los espines nucleares magnéticos en un campo magnético constante aplicado B 0 .
  2. La perturbación de esta alineación de los espines nucleares por un campo magnético oscilante débil, generalmente denominado pulso de radiofrecuencia (RF).
  3. Detección y análisis de las ondas electromagnéticas emitidas por los núcleos de la muestra como resultado de esta perturbación.

De manera similar, los bioquímicos utilizan la RMN para identificar proteínas y otras moléculas complejas. Además de la identificación, la espectroscopia de RMN proporciona información detallada sobre la estructura, la dinámica, el estado de reacción y el entorno químico de las moléculas. Los tipos más comunes de RMN son la espectroscopia de RMN de protón y de carbono-13 , pero es aplicable a cualquier tipo de muestra que contenga núcleos con espín .

Los espectros de RMN son únicos, ofrecen una buena resolución, son analíticamente manejables y, a menudo, altamente predecibles para moléculas pequeñas . Los diferentes grupos funcionales son claramente distinguibles, e incluso grupos funcionales idénticos con distintos sustituyentes vecinos generan señales distinguibles. La RMN ha reemplazado en gran medida las pruebas químicas tradicionales , como los reactivos colorimétricos o la cromatografía convencional, para la identificación de compuestos.

La principal desventaja de la espectroscopia de RMN es su baja sensibilidad (en comparación con otros métodos analíticos, como la espectrometría de masas ). Normalmente  se requieren entre 2 y 50 mg de una sustancia para obtener un espectro de RMN de calidad aceptable. El método de RMN no es destructivo, por lo que la sustancia puede recuperarse. Para obtener espectros de RMN de alta resolución, las sustancias sólidas suelen disolverse para formar soluciones líquidas, aunque también es posible la espectroscopia de RMN en estado sólido .

La escala temporal de la RMN es relativamente larga, por lo que no es adecuada para observar fenómenos rápidos, produciendo únicamente un espectro promedio. Si bien en un espectro de RMN se observan grandes cantidades de impurezas, existen mejores métodos para detectarlas, ya que la RMN no es intrínsecamente muy sensible , aunque a frecuencias más altas la sensibilidad es mayor. 

La espectroscopia de correlación es una evolución de la RMN convencional. En la RMN bidimensional , la emisión se centra en torno a una única frecuencia y se observan resonancias correlacionadas. Esto permite identificar los sustituyentes vecinos del grupo funcional observado, facilitando así la identificación inequívoca de las resonancias. Existen también métodos tridimensionales y cuatridimensionales más complejos, así como diversos métodos diseñados para suprimir o amplificar tipos específicos de resonancias. En la espectroscopia del efecto Overhauser nuclear (NOE), se observa la relajación de las resonancias. Dado que el NOE depende de la proximidad de los núcleos, su cuantificación para cada núcleo permite construir un modelo tridimensional de la molécula.

Sección transversal de un imán de RMN que muestra su estructura: blindaje contra la radiación, cámara de vacío, recipiente de nitrógeno líquido, recipiente de helio líquido y calces criogénicos . [ 2 ]

Los espectrómetros de RMN son relativamente caros; las universidades suelen tenerlos, pero son menos comunes en las empresas privadas. Entre 2000 y 2015, un espectrómetro de RMN costaba entre 0,5 y 5  millones de dólares estadounidenses . [ 3 ] [ 4 ] Los espectrómetros de RMN modernos cuentan con un imán superconductor refrigerado por helio líquido , muy potente, grande y costoso, ya que la resolución depende directamente de la intensidad del campo magnético. Un campo magnético más intenso también mejora la sensibilidad de la espectroscopia de RMN, que depende de la diferencia de población entre los dos niveles nucleares, la cual aumenta exponencialmente con la intensidad del campo magnético. 

También existen máquinas menos costosas que utilizan imanes permanentes y menor resolución, las cuales ofrecen un rendimiento suficiente para ciertas aplicaciones, como el monitoreo de reacciones y la verificación rápida de muestras. Incluso hay espectrómetros de resonancia magnética nuclear de sobremesa . Los espectros de RMN de protones ( núcleos de 1H ) pueden observarse incluso en el campo magnético terrestre . La RMN de baja resolución produce picos más anchos, que pueden superponerse fácilmente, lo que dificulta la resolución de estructuras complejas. El uso de campos magnéticos de mayor intensidad resulta en una mejor sensibilidad y mayor resolución de los picos, y es preferible para fines de investigación. [ 5 ]

Historia

El mérito del descubrimiento de la RMN se atribuye a Isidor Isaac Rabi , quien recibió el Premio Nobel de Física en 1944. [ 6 ] El grupo de Purcell en la Universidad de Harvard y el grupo de Bloch en la Universidad de Stanford desarrollaron de forma independiente la espectroscopia de RMN a finales de la década de 1940 y principios de la de 1950. Edward Mills Purcell y Felix Bloch compartieron el Premio Nobel de Física de 1952 por sus invenciones. [ 7 ]

Criterios de actividad en RMN

El determinante clave de la actividad de RMN en los núcleos atómicos es el número cuántico de espín nuclear ( I ). Esta propiedad cuántica intrínseca, similar al " espín " de un átomo, caracteriza el momento angular del núcleo. Para ser activo en RMN, un núcleo debe tener un espín nuclear distinto de cero ( I ≠ 0). [ 8 ] Es este espín distinto de cero el que permite a los núcleos interactuar con campos magnéticos externos y mostrar señales en RMN. Los átomos con una suma impar de protones y neutrones exhiben valores semienteros para el número cuántico de espín nuclear ( I = 1/2, 3/2, 5/2, etc.). Estos átomos son activos en RMN porque poseen un espín nuclear distinto de cero. Los átomos con una suma par, pero con un número impar de protones y un número impar de neutrones, exhiben espines nucleares enteros ( I = 1, 2, 3, etc.). Por el contrario, los átomos con un número par de protones y neutrones tienen un número cuántico de espín nuclear de cero ( I = 0) y, por lo tanto, no son activos en RMN. [ 9 ] Los núcleos activos en RMN, en particular aquellos con un número cuántico de espín de 1/2, son de gran importancia en la espectroscopia de RMN. Algunos ejemplos son 1 H, 13 C, 15 N y 31 P. [ 10 ]

Aspectos principales de las técnicas de RMN

Frecuencia de resonancia

Cuando se colocan en un campo magnético, los núcleos activos de RMN (como 1H o 13C ) absorben radiación electromagnética a una frecuencia característica del isótopo . [ 11 ] La frecuencia de resonancia, la energía de la radiación absorbida y la intensidad de la señal son proporcionales a la fuerza del campo magnético. Por ejemplo, en un campo magnético de 21 teslas , los núcleos de hidrógeno ( protones ) resuenan a 900  MHz. Es común referirse a un  imán de 21 T como un imán de 900 MHz , ya que el hidrógeno es el núcleo que se detecta con mayor frecuencia. Sin embargo, diferentes núcleos resonarán a diferentes frecuencias a esta intensidad de campo en proporción a sus momentos magnéticos nucleares . 

Manipulación de muestras

La muestra para RMN se prepara en un tubo de vidrio de paredes delgadas , un tubo de RMN . 

Un espectrómetro de RMN generalmente consta de un portamuestras giratorio dentro de un imán muy potente, un emisor de radiofrecuencia y un receptor con una sonda (un conjunto de antena) que se introduce en el imán para rodear la muestra, opcionalmente bobinas de gradiente para mediciones de difusión y electrónica para controlar el sistema. El giro de la muestra suele ser necesario para promediar el movimiento de difusión; sin embargo, algunos experimentos requieren una muestra estacionaria cuando el movimiento de la solución es una variable importante. Por ejemplo, las mediciones de constantes de difusión ( espectroscopia de difusión ordenada o DOSY) [ 12 ] [ 13 ] se realizan utilizando una muestra estacionaria sin giro, y se pueden utilizar celdas de flujo para el análisis en línea de flujos de procesos.

disolventes deuterados

La gran mayoría de las moléculas en una solución son moléculas de disolvente, y la mayoría de los disolventes comunes son hidrocarburos y, por lo tanto, contienen núcleos de hidrógeno-1 activos en RMN. Para evitar que las señales de los átomos de hidrógeno del disolvente saturen el experimento e interfieran en el análisis del analito disuelto, se utilizan disolventes deuterados en los que >99 % de los protones se reemplazan por deuterio (hidrógeno-2). [ 14 ] El disolvente deuterado más utilizado es el deuterocloroformo (CDCl 3 ), aunque se pueden utilizar otros disolventes por diversas razones, como la solubilidad de una muestra, el deseo de controlar los enlaces de hidrógeno o los puntos de fusión o ebullición. Los desplazamientos químicos de una molécula cambian ligeramente entre disolventes, por lo que el disolvente utilizado casi siempre se informa junto con los desplazamientos químicos. Los espectros de RMN de protón a menudo se calibran con respecto al pico de protón residual del disolvente conocido [ 15 ] como patrón interno en lugar de agregar tetrametilsilano (TMS), que convencionalmente se define como de desplazamiento químico cero. [ 16 ]

Calce y bloqueo

Para detectar los cambios de frecuencia muy pequeños debidos a la resonancia magnética nuclear, el campo magnético aplicado debe ser extremadamente uniforme en todo el volumen de la muestra. Los espectrómetros de RMN de alta resolución utilizan compensadores magnéticos para ajustar la homogeneidad del campo magnético a partes por mil millones ( ppb ) en un volumen de unos pocos centímetros cúbicos. Para detectar y compensar la inhomogeneidad y la deriva en el campo magnético, el espectrómetro mantiene un "bloqueo" en la frecuencia del deuterio del disolvente con una unidad de bloqueo separada, que es esencialmente un transmisor y procesador de RF adicional sintonizado al núcleo de bloqueo (deuterio) en lugar de a los núcleos de la muestra de interés. [ 17 ] En los espectrómetros de RMN modernos, el ajuste del campo magnético se realiza automáticamente, aunque en algunos casos el operador tiene que optimizar manualmente los parámetros del ajuste para obtener la mejor resolución posible. [ 17 ] [ 18 ]

Adquisición de espectros

Al excitar la muestra con un pulso de radiofrecuencia (60–1000 MHz), se obtiene una respuesta de resonancia magnética nuclear (FID). Se trata de una señal muy débil que requiere receptores de radio sensibles para su detección. Se realiza una transformada  de Fourier para extraer el espectro en el dominio de la frecuencia a partir de la señal FID en el dominio del tiempo. El espectro de una sola señal FID tiene una baja relación señal-ruido , pero mejora fácilmente al promediar adquisiciones repetidas. Se pueden obtener buenos espectros de RMN de 1H con 16 repeticiones, lo que solo lleva unos minutos. Sin embargo, para elementos más pesados ​​que el hidrógeno, el tiempo de relajación es bastante largo, por ejemplo, alrededor de 8 segundos para el 13C . Por lo tanto, la adquisición de espectros cuantitativos de elementos pesados ​​puede ser laboriosa, pudiendo tardar desde decenas de minutos hasta horas.   

Tras el pulso, los núcleos se excitan, en promedio, a un cierto ángulo con respecto al campo magnético del espectrómetro. El grado de excitación se puede controlar mediante la duración del pulso, que suele ser de entre 3 y 8  μs para un pulso óptimo de 90°. La duración del pulso se determina graficando la intensidad (con signo) en función de dicha duración. Esta sigue una curva sinusoidal y, por consiguiente, cambia de signo para las duraciones de pulso correspondientes a 180° y 360°.

Los tiempos de decaimiento de la excitación, que normalmente se miden en segundos, dependen de la efectividad de la relajación, que es más rápida para núcleos ligeros y en sólidos, más lenta para núcleos pesados ​​y en soluciones, y puede ser muy larga en gases. Si el segundo pulso de excitación se envía prematuramente antes de que la relajación se complete, el vector de magnetización promedio no ha decaído al estado fundamental, lo que afecta la intensidad de la señal de manera impredecible. En la práctica, las áreas de los picos no son proporcionales a la estequiometría; solo es posible discernir la presencia, pero no la cantidad de grupos funcionales. Se puede realizar un experimento de recuperación por inversión para determinar el tiempo de relajación y, por lo tanto, el retardo requerido entre pulsos. Se transmite un pulso de 180°, un retardo ajustable y un pulso de 90°. Cuando el pulso de 90° cancela exactamente la señal, el retardo corresponde al tiempo necesario para 90° de relajación. [ 19 ] La recuperación por inversión es útil para experimentos cuantitativos de 13 C, 2 D y otros experimentos que consumen mucho tiempo.

Interpretación espectral

Las señales de RMN se caracterizan habitualmente por tres variables: desplazamiento químico, acoplamiento espín-espín y tiempo de relajación.

desplazamiento químico

Ejemplo de desplazamiento químico: espectro de RMN del hexaborano B 6 H 10 que muestra picos con frecuencia desplazada, lo que proporciona pistas sobre la estructura molecular (haga clic para leer los detalles de la interpretación).

La diferencia de energía ΔE entre los estados de espín nuclear es proporcional al campo magnético ( efecto Zeeman ). ΔE también es sensible al entorno electrónico del núcleo, dando lugar a lo que se conoce como desplazamiento químico, δ. Los tipos más simples de gráficos de RMN son gráficos de los diferentes desplazamientos químicos de los núcleos estudiados en la molécula. El valor de δ se suele expresar en términos de "apantallamiento": los núcleos apantallados tienen un ΔE mayor . El rango de valores de δ se denomina dispersión. Es bastante pequeña para las señales de 1H , pero mucho mayor para otros núcleos. Las señales de RMN se informan en relación con una señal de referencia, generalmente la del TMS ( tetrametilsilano ). Además, dado que la distribución de las señales de RMN depende del campo, estas frecuencias se dividen por la frecuencia del espectrómetro. Sin embargo, como estamos dividiendo Hz por MHz, el número resultante sería demasiado pequeño, por lo que se multiplica por un millón. Esta operación da como resultado un número localizador llamado "desplazamiento químico" con unidades de partes por millón. [ 20 ] El desplazamiento químico proporciona información estructural.

La conversión de desplazamientos químicos (y J, véase más adelante) se denomina asignación del espectro. Para compuestos orgánicos diamagnéticos, las asignaciones de espectros de RMN de 1H y 13C son extremadamente complejas debido a las amplias bases de datos y las sencillas herramientas computacionales. En general, los desplazamientos químicos de los protones son altamente predecibles, ya que están determinados principalmente por efectos de apantallamiento (densidad electrónica). Los desplazamientos químicos de muchos núcleos más pesados ​​se ven más influenciados por otros factores, incluidos los estados excitados (contribución "paramagnética" al tensor de apantallamiento). Esta contribución paramagnética, que no está relacionada con el paramagnetismo , no solo altera las tendencias de los desplazamientos químicos, lo que complica las asignaciones, sino que también da lugar a rangos de desplazamiento químico muy amplios. Por ejemplo, la mayoría de las señales de RMN de 1H para la mayoría de los compuestos orgánicos se encuentran dentro de 15  ppm. Para la RMN de 31P , el rango es de cientos de ppm. [ 21 ]

En la espectroscopia de RMN paramagnética , las muestras son paramagnéticas, es decir, contienen electrones desapareados. El paramagnetismo da lugar a desplazamientos químicos muy diversos. En la espectroscopia de RMN de 1H , el rango de desplazamiento químico puede abarcar hasta miles de ppm. [ 22 ]

Acoplamiento J

Parte de la información más útil para la determinación de la estructura en un espectro de RMN unidimensional proviene del acoplamiento J, o acoplamiento escalar (un caso especial del acoplamiento espín-espín ), entre núcleos activos en RMN. Este acoplamiento surge de la interacción de diferentes estados de espín a través de los enlaces químicos de una molécula y produce el desdoblamiento de las señales de RMN. Para un protón, el campo magnético local es ligeramente diferente dependiendo de si un núcleo adyacente apunta hacia o en dirección opuesta al campo magnético del espectrómetro, lo que da lugar a dos señales por protón en lugar de una. Estos patrones de desdoblamiento pueden ser complejos o simples y, asimismo, pueden ser fácilmente interpretables o engañosos. Este acoplamiento proporciona información detallada sobre la conectividad de los átomos en una molécula.

La multiplicidad del desdoblamiento es un efecto de los espines de los núcleos acoplados y del número de dichos núcleos involucrados en el acoplamiento. El acoplamiento a n núcleos equivalentes de espín 1/2 desdobla la señal en un multiplete n  + 1 con relaciones de intensidad que siguen el triángulo de Pascal , como se describe en la tabla. El acoplamiento a espines adicionales produce desdoblamientos adicionales de cada componente del multiplete; por ejemplo, el acoplamiento a dos núcleos de espín 1/2 diferentes con constantes de acoplamiento significativamente distintas produce un doblete de dobletes (abreviatura: dd). Cabe destacar que el acoplamiento entre núcleos químicamente equivalentes (es decir, con el mismo desplazamiento químico) no afecta a los espectros de RMN, y los acoplamientos entre núcleos distantes (generalmente a más de 3 enlaces de distancia para los protones en moléculas flexibles) suelen ser demasiado pequeños para causar desdoblamientos observables. Los acoplamientos de largo alcance a través de más de tres enlaces se observan con frecuencia en compuestos cíclicos y aromáticos , lo que da lugar a patrones de desdoblamiento más complejos. 

Ejemplo 1 Espectro de RMN de 1H (unidimensional) del etanol representado como intensidad de señal frente a desplazamiento químico . Hay tres tipos diferentes de átomos de H en el etanol con respecto a la RMN: el hidrógeno (H) del grupo −OH no se acopla con los otros átomos de H y aparece como un singlete, pero los hidrógenos CH3− y −CH2− se acoplan entre sí, dando como resultado un triplete y un cuarteto respectivamente .

Por ejemplo, en el espectro de protones del etanol, el grupo CH₃ se divide en un triplete con una relación de intensidad de 1:2:1 por los dos protones CH₂ vecinos . De manera similar, el CH₂ se divide en un cuarteto con una relación de intensidad de 1:3:3:1 por los tres protones CH₃ vecinos . En principio, los dos protones CH₂ también se dividirían nuevamente en un doblete para formar un doblete de cuartetos por el protón hidroxilo, pero el intercambio intermolecular del protón hidroxilo ácido a menudo resulta en una pérdida de información de acoplamiento.

El acoplamiento a núcleos con espín 1/2, como el fósforo-31 o el flúor-19, funciona de esta manera (aunque las magnitudes de las constantes de acoplamiento pueden ser muy diferentes). Sin embargo, los patrones de desdoblamiento difieren de los descritos anteriormente para núcleos con espín mayor que 1/2, ya que el número cuántico de espín tiene más de dos valores posibles. Por ejemplo, el acoplamiento al deuterio (un núcleo de espín 1) desdobla la señal en un triplete 1:1:1 porque el espín  1 tiene tres estados de espín. De manera similar, un núcleo de espín 3/2, como el 35Cl , desdobla una señal en un cuarteto 1:1:1:1, y así sucesivamente.

El acoplamiento, junto con el desplazamiento químico (y la integración para los protones), nos informa no solo sobre el entorno químico de los núcleos, sino también sobre la cantidad de núcleos activos en RMN vecinos dentro de la molécula. En espectros más complejos con múltiples picos a desplazamientos químicos similares o en espectros de núcleos distintos del hidrógeno, el acoplamiento suele ser la única forma de distinguir diferentes núcleos.

La magnitud del acoplamiento (la constante de acoplamiento J ) depende de la intensidad del acoplamiento entre los núcleos. En casos sencillos, esto se debe a la distancia de enlace entre los núcleos, al momento magnético de los núcleos y al ángulo diedro entre ellos.

Acoplamiento de segundo orden (o fuerte)

Espectro de RMN de 1H del mentol con el desplazamiento químico en ppm en el eje horizontal. Cada protón magnéticamente no equivalente tiene un desplazamiento característico, y los acoplamientos con otros protones aparecen como una división de los picos en multipletes: por ejemplo, el pico a , debido a que los tres protones magnéticamente equivalentes en el grupo metilo a se acoplan a un protón adyacente ( e ) y, por lo tanto, aparece como un doblete.

La descripción anterior presupone que la constante de acoplamiento es pequeña en comparación con la diferencia en las frecuencias de RMN entre los espines no equivalentes. Si la separación de desplazamiento disminuye (o la fuerza de acoplamiento aumenta), los patrones de intensidad de los multipletes se distorsionan primero y luego se vuelven más complejos y difíciles de analizar (especialmente si hay más de dos espines involucrados). La intensificación de algunos picos en un multiplete se logra a expensas del resto, que a veces casi desaparece en el ruido de fondo, aunque el área integrada bajo los picos permanece constante. Sin embargo, en la mayoría de los experimentos de RMN de alto campo, las distorsiones suelen ser moderadas, y las distorsiones características ( efecto techo ) pueden, de hecho, ayudar a identificar picos relacionados.

Algunos de estos patrones pueden analizarse con el método publicado por John Pople , [ 23 ] aunque tiene un alcance limitado.

Los efectos de segundo orden disminuyen a medida que aumenta la diferencia de frecuencia entre los multipletes, de modo que los espectros de RMN de campo alto (es decir, de alta frecuencia) presentan menos distorsión que los espectros de menor frecuencia. Los primeros espectros a 60  MHz eran más propensos a la distorsión que los espectros de equipos posteriores que operaban normalmente a frecuencias de 200  MHz o superiores.

Además, como se muestra en la figura de la derecha, el acoplamiento J puede utilizarse para identificar la sustitución orto-meta-para de un anillo. El acoplamiento orto es el más fuerte, con 15  Hz; le sigue el meta, con un promedio de 2  Hz; y, por último, el acoplamiento para suele ser insignificante para los estudios.

Desequivalencia magnética

Pueden producirse efectos más sutiles si los espines químicamente equivalentes (es decir, núcleos relacionados por simetría y, por lo tanto, con la misma frecuencia de RMN) presentan diferentes relaciones de acoplamiento con espines externos. Los espines que son químicamente equivalentes pero no indistinguibles (en función de sus relaciones de acoplamiento) se denominan magnéticamente no equivalentes. Por ejemplo, los cuatro átomos de hidrógeno del 1,2-diclorobenceno se dividen en dos pares químicamente equivalentes por simetría, pero un miembro individual de uno de los pares presenta acoplamientos diferentes con los espines que componen el otro par.

La inequivalencia magnética puede dar lugar a espectros muy complejos, que solo pueden analizarse mediante modelado computacional. Estos efectos son más comunes en los espectros de RMN de sistemas aromáticos y otros sistemas no flexibles, mientras que el promedio conformacional alrededor de los enlaces C−C en moléculas flexibles tiende a igualar los acoplamientos entre protones en carbonos adyacentes, reduciendo los problemas de inequivalencia magnética.

Espectroscopia de correlación

La espectroscopia de correlación es uno de los varios tipos de espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) bidimensional o RMN 2D . Este tipo de experimento de RMN es más conocido por su acrónimo , COSY . Otros tipos de RMN bidimensional incluyen la espectroscopia J, la espectroscopia de intercambio (EXSY), la espectroscopia de efecto Overhauser nuclear (NOESY), la espectroscopia de correlación total (TOCSY) y los experimentos de correlación heteronuclear, como HSQC , HMQC y HMBC . En la espectroscopia de correlación, la emisión se centra en el pico de un núcleo individual; si su campo magnético está correlacionado con otro núcleo mediante acoplamiento a través de enlaces (COSY, HSQC, etc.) o a través del espacio (NOE), también se puede detectar una respuesta en la frecuencia del núcleo correlacionado. Los espectros de RMN bidimensionales proporcionan más información sobre una molécula que los espectros de RMN unidimensionales y son especialmente útiles para determinar la estructura de una molécula , particularmente para aquellas moléculas demasiado complejas para trabajar con RMN unidimensional. El primer experimento bidimensional, COSY, fue propuesto por Jean Jeener, profesor de la Université Libre de Bruxelles, en 1971. [ 24 ] [ 25 ] Este experimento fue implementado posteriormente por Walter P. Aue, Enrico Bartholdi y Richard R. Ernst , quienes publicaron su trabajo en 1976. [ 26 ]

Resonancia magnética nuclear de estado sólido

Espectrómetro de RMN de estado sólido de 900 MHz (21,1 T [ 27 ] ) en la Instalación Nacional Canadiense de RMN de Campo Ultraalto para Sólidos

Diversas circunstancias físicas impiden el estudio de las moléculas en disolución, y tampoco mediante otras técnicas espectroscópicas a nivel atómico. En medios de fase sólida, como cristales, polvos microcristalinos, geles, disoluciones anisotrópicas, etc., el acoplamiento dipolar y la anisotropía del desplazamiento químico se vuelven dominantes en el comportamiento de los sistemas de espín nuclear. En la espectroscopia de RMN convencional en disolución, estas interacciones adicionales provocarían un ensanchamiento significativo de las líneas espectrales. Diversas técnicas permiten establecer condiciones de alta resolución que, al menos para los espectros de 13C , pueden ser comparables a los espectros de RMN en disolución.

Dos conceptos importantes para la espectroscopia de RMN de estado sólido de alta resolución son la limitación de la orientación molecular mediante la orientación de la muestra y la reducción de las interacciones magnéticas nucleares anisotrópicas mediante la rotación de la muestra. De este último enfoque, la rotación rápida alrededor del ángulo mágico es un método muy destacado cuando el sistema comprende núcleos de espín 1/2. Se utilizan velocidades de rotación de aproximadamente 20 kHz, lo que requiere equipos especiales. Actualmente , en la espectroscopia de RMN se utilizan  diversas técnicas intermedias con muestras de alineación parcial o movilidad reducida.

Las aplicaciones en las que se producen efectos de RMN de estado sólido suelen estar relacionadas con investigaciones estructurales de proteínas de membrana, fibrillas proteicas o todo tipo de polímeros, y análisis químicos en química inorgánica, pero también incluyen aplicaciones "exóticas" como las hojas de las plantas y las pilas de combustible. Por ejemplo, Rahmani et al. estudiaron el efecto de la presión y la temperatura en el autoensamblaje de estructuras bicelares mediante espectroscopia de RMN de deuterio. [ 28 ] La RMN de estado sólido también es útil para comprender la estructura de metales en el caso de muestras de metales amorfos a rayos X (como el metal refractario de tamaño nanométrico 99 Tc). [ 29 ] Estudios recientes han combinado la RMN de estado sólido con simulaciones de dinámica molecular para resolver movimientos a escala de nanosegundos a milisegundos en materiales hidratados como el carbonato de calcio amorfo. [ 30 ]

Espectroscopia de RMN biomolecular

Proteínas

Gran parte de la innovación en espectroscopia de RMN se ha centrado en la espectroscopia de RMN de proteínas , una técnica importante en biología estructural . Un objetivo común de estas investigaciones es obtener estructuras tridimensionales de alta resolución de la proteína, similares a las que se pueden lograr mediante cristalografía de rayos X. A diferencia de la cristalografía de rayos X, la espectroscopia de RMN suele limitarse a proteínas de menos de 35 kDa , aunque se han resuelto estructuras de mayor tamaño. La espectroscopia de RMN suele ser la única forma de obtener información de alta resolución sobre proteínas parcial o totalmente intrínsecamente desestructuradas . Actualmente, es una herramienta común para la determinación de las relaciones conformación-actividad, donde la estructura antes y después de la interacción con, por ejemplo, un fármaco candidato, se compara con su actividad bioquímica conocida. Las proteínas son órdenes de magnitud mayores que las pequeñas moléculas orgánicas mencionadas anteriormente en este artículo, pero las técnicas básicas de RMN y parte de la teoría de RMN también son aplicables. Debido a la mayor cantidad de átomos presentes en una molécula de proteína en comparación con un compuesto orgánico pequeño, los espectros básicos 1D se saturan con señales superpuestas hasta el punto de que el análisis espectral directo resulta inviable. Por lo tanto, se han ideado experimentos multidimensionales (2D, 3D o 4D) para abordar este problema. Para facilitar estos experimentos, es conveniente marcar isotópicamente la proteína con 13C y 15N , ya que el isótopo predominante en la naturaleza, 12C , no es activo en RMN y el momento cuadrupolar nuclear del isótopo predominante en la naturaleza, 14N , impide obtener información de alta resolución de este isótopo de nitrógeno. El método más importante utilizado para la determinación de la estructura de las proteínas utiliza experimentos de NOE para medir las distancias entre los átomos dentro de la molécula. Posteriormente, las distancias obtenidas se utilizan para generar una estructura 3D de la molécula resolviendo un problema de geometría de distancias . La RMN también puede utilizarse para obtener información sobre la dinámica y la flexibilidad conformacional de diferentes regiones de una proteína.

Ácidos nucleicos

La RMN de ácidos nucleicos es el uso de la espectroscopia de RMN para obtener información sobre la estructura y la dinámica de los ácidos polinucleares , como el ADN o el ARN . A partir de 2003, casi la mitad de todas las estructuras de ARN conocidas se habían determinado mediante espectroscopia de RMN. [ 31 ]

La espectroscopia de RMN de ácidos nucleicos y proteínas es similar, pero existen diferencias. Los ácidos nucleicos tienen un menor porcentaje de átomos de hidrógeno, que son los átomos que se suelen observar en la espectroscopia de RMN, y debido a que las dobles hélices de los ácidos nucleicos son rígidas y aproximadamente lineales, no se pliegan sobre sí mismas para dar correlaciones de "largo alcance". [ 32 ] Los tipos de RMN que se suelen realizar con ácidos nucleicos son RMN de 1H o protón , RMN de 13C , RMN de 15N y RMN de 31P . Casi siempre se utilizan métodos de RMN bidimensionales , como la espectroscopia de correlación (COSY) y la espectroscopia de transferencia de coherencia total (TOCSY) para detectar acoplamientos nucleares a través de enlaces, y la espectroscopia de efecto Overhauser nuclear (NOESY) para detectar acoplamientos entre núcleos que están cerca uno del otro en el espacio. [ 33 ]

Los parámetros obtenidos del espectro, principalmente los picos cruzados NOESY y las constantes de acoplamiento , pueden utilizarse para determinar características estructurales locales como los ángulos de los enlaces glucosídicos , los ángulos diedros (utilizando la ecuación de Karplus ) y las conformaciones de plegamiento del azúcar. Para la estructura a gran escala, estos parámetros locales deben complementarse con otras suposiciones o modelos estructurales, ya que los errores se acumulan al recorrer la doble hélice y, a diferencia de las proteínas, la doble hélice no tiene un interior compacto ni se pliega sobre sí misma. La RMN también es útil para investigar geometrías no estándar como hélices curvadas , apareamiento de bases no Watson-Crick y apilamiento coaxial . Ha sido especialmente útil para estudiar la estructura de los oligonucleótidos de ARN naturales, que tienden a adoptar conformaciones complejas como bucles de tallo y pseudonudos . La RMN también es útil para estudiar la unión de moléculas de ácido nucleico a otras moléculas, como proteínas o fármacos, observando qué resonancias se desplazan al unirse la otra molécula. [ 33 ]

Carbohidratos

La espectroscopia de RMN de carbohidratos aborda cuestiones sobre la estructura y conformación de los carbohidratos . El análisis de carbohidratos mediante RMN de 1H es complejo debido a la limitada variación de los grupos funcionales, lo que provoca que las resonancias de 1H se concentren en bandas estrechas del espectro de RMN. En otras palabras, existe una dispersión espectral deficiente. Las resonancias de los protones anoméricos se encuentran separadas de las demás debido a que los carbonos anoméricos poseen dos átomos de oxígeno. Para carbohidratos más pequeños, la dispersión de las resonancias de los protones anoméricos facilita el uso de experimentos TOCSY 1D para investigar los sistemas de espín completos de los residuos de carbohidratos individuales.

descubrimiento de fármacos

El conocimiento de los mínimos de energía y las barreras de energía rotacional de moléculas pequeñas en solución se puede obtener mediante RMN, por ejemplo, analizando las preferencias conformacionales y la dinámica conformacional del ligando libre, respectivamente. Esto puede utilizarse para orientar las hipótesis de diseño de fármacos, ya que los valores experimentales y calculados son comparables. Por ejemplo, AstraZeneca utiliza la RMN para su investigación y desarrollo en oncología. [ 34 ]

Espectroscopia de RMN de alta presión

Uno de los primeros trabajos científicos dedicados al uso de la presión como parámetro variable en experimentos de RMN fue el trabajo de J.  Jonas publicado en la revista Annual Review of Biophysics en 1994. [ 35 ] El uso de altas presiones en la espectroscopia de RMN fue impulsado principalmente por el deseo de estudiar sistemas bioquímicos, donde el uso de alta presión permite cambios controlados en las interacciones intermoleculares sin perturbaciones significativas.

Por supuesto, se han realizado intentos para resolver problemas científicos mediante espectroscopia de RMN de alta presión. Sin embargo, la mayoría de ellos resultaron difíciles de reproducir debido a la dificultad de contar con el equipo necesario para generar y mantener alta presión. En [ 36 ] [ 37 ] [ 38 ] se describen los tipos más comunes de celdas de RMN para la realización de experimentos de RMN de alta presión.

La espectroscopia de RMN de alta presión se ha utilizado ampliamente para diversas aplicaciones, principalmente relacionadas con la caracterización de la estructura de las moléculas de proteínas. [ 39 ] [ 40 ] Sin embargo, en los últimos años, se han propuesto soluciones de software y diseño para caracterizar las estructuras químicas y espaciales de moléculas pequeñas en un entorno de fluido supercrítico, [ 41 ] utilizando parámetros de estado como fuerza impulsora de dichos cambios. [ 42 ]

Véase también

Métodos relacionados de espectroscopia nuclear :

Referencias

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Lecturas adicionales

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  • James Keeler. "Understanding NMR Spectroscopy" (reimpreso en la Universidad de Cambridge ) . Universidad de California, Irvine . Consultado el 11 de mayo de 2007 .
  • Fundamentos de la RMN : Una introducción no técnica a la teoría, el equipo y las técnicas de la RMN, por el Dr. Joseph Hornak, profesor de Química en el RIT.
  • Bibliotecas GAMMA y PyGAMMA : GAMMA es una biblioteca de código abierto en C++ escrita para la simulación de experimentos de espectroscopia de resonancia magnética nuclear. PyGAMMA es una interfaz de Python para GAMMA.
  • Relax Software para el análisis de la dinámica de RMN
  • Vespa - VeSPA (Versatile Simulation, Pulses and Analysis) es un paquete de software libre compuesto por tres aplicaciones Python. Estas herramientas con interfaz gráfica de usuario (GUI) se utilizan para la simulación espectral de resonancia magnética (RM), el diseño de pulsos de radiofrecuencia (RF) y el procesamiento y análisis espectral de datos de RM.
  • Jaroslaw Jazwinski "Espectroscopia de resonancia magnética nuclear en química orgánica: fundamentos teóricos y técnicas de medición"
  • Witold Danikiewicz, Olga Staszewska-Krajewska "Espectroscopia de resonancia magnética nuclear en química orgánica: métodos básicos y avanzados de interpretación de espectros"