Nitrilasa

Las enzimas nitrilasas ( nitrilo aminohidrolasa ; EC 3.5.5.1 ) catalizan la hidrólisis de nitrilos a ácidos carboxílicos y amoníaco , sin la formación de intermedios amida "libres". ^{[ 1 ]} Las nitrilasas participan en la biosíntesis de productos naturales y en modificaciones postraduccionales en plantas, animales, hongos y ciertos procariotas. Las nitrilasas también pueden utilizarse como catalizadores en química orgánica preparativa. Entre otras aplicaciones, se han utilizado para la resolución de mezclas racémicas . La nitrilasa no debe confundirse con la nitrilo hidratasa (nitrilo hidroliasa; EC 4.2.1.84 ), que hidroliza nitrilos a amidas. Las nitrilo hidratasas se coexpresan casi invariablemente con una amidasa, que convierte la amida en el ácido carboxílico. En consecuencia, a veces puede resultar difícil distinguir la actividad de la nitrilasa de la actividad de la nitrilo hidratasa más la actividad de la amidasa.

La nitrilasa se descubrió a principios de la década de 1960 por su capacidad para catalizar la hidratación de un nitrilo a un ácido carboxílico . ^{[ 2 ]} Aunque en ese momento se sabía que la nitrilasa podía operar con una amplia especificidad de sustrato en la producción del ácido correspondiente, estudios posteriores informaron la primera actividad de NHasa ( nitrilo hidratasa ) exhibida por la nitrilasa. ^{[ 3 ] [ 4 ]} Es decir, los compuestos amida también podrían formarse mediante hidrólisis de nitrilo . Investigaciones posteriores han revelado varias condiciones que promueven la formación de amida, las cuales se describen a continuación. ^{[ 4 ]}

• Liberación temprana del sustrato unido a la enzima después de la primera hidrólisis del agua seguida de la adición retardada de la segunda agua.
• Condiciones de baja temperatura y pH elevado. Para las bioconversiones mediante nitrilasa en la mayoría de las bacterias y hongos, el rango óptimo de pH se encuentra entre 7,0 y 8,0, y el rango óptimo de temperatura se encuentra entre 30 y 50  °C.
• Grupos electroatractores en la posición ⍺

A continuación se muestra una lista de los pasos involucrados en la transformación de un compuesto nitrilo genérico con nitrilasa: ^{[ 4 ]}

1. El carbono electrófilo del nitrilo está sujeto al ataque nucleofílico de uno de los dos grupos SH de la nitrilasa.
2. El tioimidato formado se hidroliza posteriormente a la acilenzima y se genera amoníaco como subproducto.
3. La acilenzima puede seguir una de dos vías dependiendo de las condiciones resaltadas anteriormente:
   • La hidrólisis posterior de la acilenzima con agua produce el ácido carboxílico y la enzima regenerada.
   • La acilenzima es hidrolizada por el amoníaco, desplazando la enzima y formando el producto amida.

La mayoría de las nitrilasas están formadas por un único polipéptido que oscila entre 32 y 45 kDa, ^{[ 7 ]} y su estructura es un plegamiento ⍺-β-β-⍺. ^{[ 4 ]} La forma preferida de la enzima es un filamento grande que consta de 6 a 26 subunidades . ^{[ 7 ]} La ​​nitrilasa aprovecha la tríada catalítica Lys - Cys - Glu , que es esencial para la función de su sitio activo y para mejorar su rendimiento. ^{[ 4 ] [ 7 ]}

La estructura de una nitrilasa termoactiva de P. abyssi consiste en un dímero con simetría de 2x en el que cada subunidad contiene 262 residuos. ^{[ 8 ] [ 9 ]} De forma similar a otras nitrilasas de la familia de las nitrilasas, cada subunidad tiene un plegamiento tipo sándwich ⍺-β-β-⍺; cuando las dos subunidades se unen e interactúan, la proteína forma una estructura de "supersándwich" (⍺-β-β-⍺-⍺-β-β-⍺). ^{[ 6 ]} Para dimerizarse, los extremos C-terminales de cada subunidad se extienden desde el núcleo e interactúan entre sí, lo que es posible en gran medida gracias a los puentes salinos formados entre los residuos de arginina y glutamato . ^{[ 6 ]}

Aunque el mecanismo exacto de unión al sustrato nitrilo aún se desconoce, al comparar la secuencia y la estructura con otras nitrilasas, se determinó que la tríada catalítica consta de Glu 42, Lys 113 y Cys 146. ^{[ 6 ] [ 4 ] [ 7 ]} Con la ayuda de programas de modelado de proteínas, se observó que Glu 42 es la base catalítica en la activación del nucleófilo (Cys 146) debido a la distancia relativamente corta entre el O en Glu y el S en Cys. Asimismo, se infirió que Lys 113 es el ácido catalítico responsable de la transferencia de protones al sustrato. ^{[ 8 ] [ 10 ]}

Las nitrilasas tienen funciones críticas en las interacciones planta-microbio para la defensa, desintoxicación , utilización de nitrógeno y síntesis de hormonas vegetales. ^{[ 11 ]} En las plantas, hay dos grupos distinguibles con respecto a la especificidad del sustrato: aquellos con alta actividad hidrolítica hacia arilacetonitrilos y aquellos con alta actividad hacia β-ciano- L -alanina . NIT1, 2 y 3 de la especie A. thaliana son ejemplos del primer grupo de nitrilasas vegetales ( arilacetonitrilasas ) que hidrolizan los nitrilos producidos durante la síntesis o degradación de glucósidos cianogénicos y glucosinolatos . Los sustratos de arilcetonitrilo para estas enzimas particulares consisten en fenilpropionitrilo y otros productos que resultan del metabolismo de los glucosinolatos. ^{[ 11 ] [ 12 ]} NIT4, sin embargo, pertenece al segundo grupo de nitrilasas vegetales y es crítico para la desintoxicación de cianuro en las plantas. ^{[ 3 ] [ 11 ] [ 13 ]}

Además, los microbios también podrían potencialmente utilizar la nitrilasa para desintoxicar y asimilar nitrilos y cianuro que existen en el entorno de la planta. ^{[ 11 ]} Un ejemplo de esto es la β-ciano- L -alanina nitrilasa de la bacteria vegetal P. fluorescens SBW25. ^{[ 14 ]} Aunque se desconoce si esta bacteria vegetal encuentra niveles tóxicos de β-ciano-ʟ-alanina en entornos naturales, se ha observado actividad de nitrilasa en plantas cianogénicas; por lo tanto, parece que la nitrilasa sirve como un mecanismo predominante para desintoxicar cianuro en lugar de β-ciano-ʟ-alanina. ^{[ 11 ] [ 14 ]} Otras aplicaciones bacterianas de las nitrilasas producidas por microorganismos asociados a plantas incluyen la degradación de nitrilos de plantas para una fuente de carbono y nitrógeno. P. fluorescens EBC191 hidroliza muchos arilacetonitrilos, en particular el mandelonitrilo , que sirve como defensa contra los herbívoros. ^{[ 11 ] [ 15 ] [ 16 ]}

• Winkler M, Glieder A, Klempier N (marzo de 2006). "El estabilizador enzimático DTT cataliza la hidrólisis de nitrilos mediante un análogo de la nitrilasa". Chemical Communications (12): 1298–300 . doi : 10.1039/B516937B . PMID 16538253 . 

• nitrilasa en los Encabezamientos de Materias Médicas (MeSH) de la Biblioteca Nacional de Medicina de EE. UU.