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Northern blot

Diagrama de flujo que describe el procedimiento general para la detección de ARN mediante transferencia Northern. El Northern blot , o Northern blot, [ 1 ] es una técnica utiliz...

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Diagrama de flujo que describe el procedimiento general para la detección de ARN mediante transferencia Northern.

El Northern blot , o Northern blot, [ 1 ] es una técnica utilizada en la investigación de biología molecular para estudiar la expresión génica mediante la detección de ARN (o ARNm aislado ) en una muestra. [ 2 ] [ 3 ]

Con el Northern blotting es posible observar el control celular sobre la estructura y la función al determinar las tasas particulares de expresión génica durante la diferenciación y la morfogénesis , así como en condiciones anormales o patológicas. [ 4 ] El Northern blotting implica el uso de electroforesis para separar muestras de ARN por tamaño y detección con una sonda de hibridación complementaria a parte o a la totalidad de la secuencia objetivo. Estrictamente hablando, el término "Northern blot" se refiere específicamente a la transferencia capilar de ARN desde el gel de electroforesis a la membrana de transferencia. Sin embargo, todo el proceso se conoce comúnmente como Northern blotting. [ 5 ] La técnica Northern blotting fue desarrollada en 1977 por James Alwine, David Kemp y George Stark en la Universidad de Stanford . [ 6 ] El Northern blotting toma su nombre de su similitud con la primera técnica de transferencia, el Southern blot , llamado así por el biólogo Edwin Southern . [ 2 ] La principal diferencia es que en el Northern blotting se analiza ARN, en lugar de ADN . [ 7 ]

Procedimiento

Un procedimiento general de transferencia [ 5 ] comienza con la extracción de ARN total de una muestra de tejido homogeneizado o de células. El ARNm eucariota se puede aislar mediante cromatografía de oligo(dT)celulosa para aislar solo aquellos ARN con una cola de poli(A) . [ 8 ] [ 9 ] Las muestras de ARN se separan luego por electroforesis en gel. Dado que los geles son frágiles y las sondas no pueden entrar en la matriz, las muestras de ARN, ahora separadas por tamaño, se transfieren a una membrana de nailon mediante un sistema de transferencia capilar o al vacío.

Sistema de transferencia capilar configurado para la transferencia de ARN desde un gel de electroforesis a una membrana de transferencia.

Una membrana de nailon con carga positiva es la más eficaz para su uso en la transferencia Northern, ya que los ácidos nucleicos con carga negativa tienen una alta afinidad por ella. El tampón de transferencia utilizado para la transferencia suele contener formamida porque reduce la temperatura de hibridación de la interacción sonda-ARN, eliminando así la necesidad de altas temperaturas, que podrían causar la degradación del ARN. [ 10 ] Una vez que el ARN se ha transferido a la membrana, se inmoviliza mediante un enlace covalente a la membrana mediante luz UV o calor. Después de que una sonda ha sido marcada, se hibrida con el ARN en la membrana. Las condiciones experimentales que pueden afectar la eficiencia y especificidad de la hibridación incluyen la fuerza iónica, la viscosidad, la longitud del dúplex, los pares de bases no coincidentes y la composición de bases. [ 11 ] La membrana se lava para asegurar que la sonda se haya unido específicamente y para evitar que aparezcan señales de fondo. Las señales híbridas se detectan luego mediante película de rayos X y se pueden cuantificar por densitometría . Para crear controles para la comparación en un Northern blot, se pueden utilizar muestras que no muestren el producto génico de interés después de la determinación mediante microarrays o RT-PCR . [ 11 ]

Geles

Se realizó una electroforesis de ARN en gel de agarosa con formaldehído para resaltar las subunidades ribosómicas 28S (banda superior) y 18S (banda inferior).

Las muestras de ARN se separan comúnmente en geles de agarosa que contienen formaldehído como agente desnaturalizante para el ARN para limitar la estructura secundaria. [ 11 ] [ 12 ] Los geles se pueden teñir con bromuro de etidio (EtBr) y observar bajo luz UV para observar la calidad y cantidad de ARN antes de la transferencia. [ 11 ] La electroforesis en gel de poliacrilamida con urea también se puede utilizar en la separación de ARN, pero se utiliza más comúnmente para ARN fragmentado o microARN. [ 13 ] A menudo se corre un marcador de ARN junto con las muestras en un gel de electroforesis para observar el tamaño de los fragmentos obtenidos, pero en muestras de ARN total las subunidades ribosómicas pueden actuar como marcadores de tamaño. [ 11 ] Dado que la subunidad ribosómica grande es 28S (aproximadamente 5 kb) y la subunidad ribosómica pequeña es 18S (aproximadamente 2 kb), aparecen dos bandas prominentes en el gel, la mayor con una intensidad casi el doble que la menor. [ 11 ] [ 14 ]

Sondas

Las sondas para Northern blotting están compuestas de ácidos nucleicos con una secuencia complementaria a la totalidad o parte del ARN de interés. Pueden ser ADN, ARN u oligonucleótidos con un mínimo de 25 bases complementarias a la secuencia diana. [ 5 ] Las sondas de ARN (ribosondas) que se transcriben in vitro pueden soportar pasos de lavado más rigurosos, lo que previene parte del ruido de fondo. [ 11 ] Comúnmente, se crea ADNc con cebadores marcados para la secuencia de ARN de interés para que actúe como sonda en el Northern blot. [ 15 ] Las sondas deben estar marcadas con isótopos radiactivos ( 32 P ) o con quimioluminiscencia en la que la fosfatasa alcalina o la peroxidasa de rábano picante (HRP) degradan los sustratos quimioluminiscentes produciendo una emisión de luz detectable. [ 16 ] El marcaje quimioluminiscente puede ocurrir de dos maneras: o la sonda está unida a la enzima, o la sonda está marcada con un ligando (p. ej. biotina ) para el cual el ligando (p. ej., avidina o estreptavidina ) está unido a la enzima (p. ej. HRP). [ 11 ] La película de rayos X puede detectar tanto las señales radiactivas como las quimioluminiscentes y muchos investigadores prefieren las señales quimioluminiscentes porque son más rápidas, más sensibles y reducen los riesgos para la salud asociados con los marcadores radiactivos. [ 16 ] La misma membrana puede ser analizada hasta cinco veces sin una pérdida significativa del ARN objetivo. [ 10 ]

Aplicaciones

La transferencia Northern permite observar el patrón de expresión de un gen en particular entre tejidos, órganos, etapas de desarrollo, niveles de estrés ambiental, infección por patógenos y durante el curso del tratamiento. [ 9 ] [ 15 ] [ 17 ] La técnica se ha utilizado para mostrar la sobreexpresión de oncogenes y la regulación negativa de genes supresores de tumores en células cancerosas en comparación con tejido "normal", [ 11 ] así como la expresión génica en el rechazo de órganos trasplantados. [ 18 ] Si se observa un gen regulado positivamente por una abundancia de ARNm en la transferencia Northern, la muestra se puede secuenciar para determinar si el gen es conocido por los investigadores o si es un hallazgo novedoso. [ 18 ] Los patrones de expresión obtenidos bajo condiciones dadas pueden proporcionar información sobre la función de ese gen. Dado que el ARN se separa primero por tamaño, si solo se utiliza un tipo de sonda, la variación en el nivel de cada banda en la membrana puede proporcionar información sobre el tamaño del producto, sugiriendo productos de empalme alternativos del mismo gen o motivos de secuencia repetitivos. [ 8 ] [ 14 ] La variación en el tamaño de un producto génico también puede indicar deleciones o errores en el procesamiento del transcrito. Al alterar la sonda diana utilizada a lo largo de la secuencia conocida, es posible determinar qué región del ARN falta. [ 2 ]

Ventajas y desventajas

El análisis de la expresión génica se puede realizar mediante varios métodos diferentes, incluyendo RT-PCR, ensayos de protección de ARNasa, microarrays, RNA-Seq , análisis serial de la expresión génica (SAGE), así como Northern blotting. [ 4 ] [ 5 ] Los microarrays son bastante comunes y suelen ser consistentes con los datos obtenidos de Northern blotting; sin embargo, en ocasiones, Northern blotting puede detectar pequeños cambios en la expresión génica que los microarrays no pueden. [ 19 ] La ventaja de los microarrays sobre Northern blotting es que se pueden visualizar miles de genes a la vez, mientras que Northern blotting generalmente analiza uno o un pequeño número de genes. [ 17 ] [ 19 ]

Un problema frecuente en la transferencia Northern es la degradación de la muestra por RNasas (tanto endógenas como por contaminación ambiental), que puede evitarse mediante la esterilización adecuada del material de vidrio y el uso de inhibidores de RNasa como el DEPC ( dietilpirocarbonato ). [ 5 ] Los productos químicos utilizados en la mayoría de las transferencias Northern pueden suponer un riesgo para el investigador, ya que el formaldehído, el material radiactivo, el bromuro de etidio, el DEPC y la luz UV son perjudiciales en determinadas exposiciones. [ 11 ] En comparación con la RT-PCR, la transferencia Northern tiene una baja sensibilidad, pero también una alta especificidad, lo cual es importante para reducir los resultados falsos positivos. [ 11 ]

Las ventajas de utilizar la transferencia Northern incluyen la detección del tamaño del ARN, la observación de productos de empalme alternativos, el uso de sondas con homología parcial, la posibilidad de medir la calidad y cantidad de ARN en el gel antes de la transferencia, y la posibilidad de almacenar y volver a analizar las membranas durante años después de la transferencia. [ 11 ]

Para la detección del ARNm de la acetilcolinesterasa mediante Northern blot , se comparó la técnica no radiactiva con una técnica radiactiva y se encontró que era igual de sensible, pero no requiere protección contra la radiación y consume menos tiempo. [ 20 ]

Northern blot inverso

En ocasiones, los investigadores utilizan una variante del procedimiento conocida como Northern blot inverso. En este procedimiento, el ácido nucleico sustrato (que se fija a la membrana) es una colección de fragmentos de ADN aislados, y la sonda es ARN extraído de un tejido y marcado radiactivamente. El uso de microarrays de ADN, que se generalizó a finales de la década de 1990 y principios de la de 2000, se asemeja más al procedimiento inverso, ya que implica el uso de fragmentos de ADN aislados fijados a un sustrato y la hibridación con una sonda elaborada a partir de ARN celular. De este modo, el procedimiento inverso, aunque inicialmente poco común, permitió que el análisis Northern evolucionara hacia el perfilado de la expresión génica , en el que se puede monitorizar la expresión de muchos (posiblemente todos) los genes de un organismo.

Véase también

Referencias

  1. ↑ Gilbert, SF (2000) Biología del desarrollo, 6.ª ed. Sunderland, MA, Sinauer Associates.
  2. 1 2 3 Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J. Raff, M., Roberts, K., Walter, P. 2008. Biología molecular de la célula, 5.ª ed. Garland Science, Taylor & Francis Group, NY, pp. 538–539.
  3. ↑ Kevil, CG, Walsh, L., Laroux, FS, Kalogeris, T., Grisham, MB, Alexander, JS (1997) Un protocolo Northern rápido y mejorado. Biochem. and Biophys. Research Comm. 238:277–279.
  4. ^ Schlamp , K.; Weinmann, A.; Krupp, M.; Maass, T.; Galle, PR; Teufel, A. (2008). "BlotBase: una base de datos de transferencia del norte". Gen.​ 427 ( 1– 2): 47– 50. doi : 10.1016/j.gene.2008.08.026 . PMID 18838116 . 
  5. 1 2 3 4 5 Trayhurn, P. (1996) Northern Blotting. Proc. Nutrition Soc. 55:583–589.
  6. ↑ Alwine JC, Kemp DJ, Stark GR (1977). "Método para la detección de ARN específicos en geles de agarosa mediante transferencia a papel de diazobenziloximetilo e hibridación con sondas de ADN" . Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 74 (12 ) : 5350– 4. Bibcode : 1977PNAS...74.5350A . doi : 10.1073/pnas.74.12.5350 . PMC 431715. PMID 414220 .  
  7. ↑ Bor, YC; Swartz, J.; Li, Y.; Coyle, J.; Rekosh, D.; Hammarskjold, Marie-Louise (2006). "Análisis Northern Blot de ARNm de polirribosomas de mamíferos" . Nature Protocols . doi : 10.1038/nprot.2006.216 .
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  9. 1 2 Mori, H.; Takeda-Yoshikawa, Y.; Hara-Nishimura, I.; Nishimura, M. (1991). "Clonación y secuenciación del ADNc de la malato sintasa de calabaza y análisis Northern blot". Eur. J. Biochem . 197 (2): 331– 336. doi : 10.1111/j.1432-1033.1991.tb15915.x . PMID 1709098 . 
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