mancha del noroeste

La transferencia Northwestern , también conocida como ensayo Northwestern , es una técnica analítica híbrida que combina la transferencia Western y la transferencia Northern , y se utiliza en biología molecular para detectar interacciones entre ARN y proteínas . La transferencia Western, una técnica relacionada, se utiliza para detectar una proteína de interés mediante la transferencia de proteínas separadas por electroforesis en gel a una membrana de nitrocelulosa. Un precipitado coloreado se agrupa a lo largo de la banda de la membrana que contiene la proteína diana específica. La transferencia Northern es una técnica analítica similar que, en lugar de detectar una proteína de interés, se utiliza para estudiar la expresión génica mediante la detección de ARN (o ARNm aislado) en una membrana similar. La transferencia Northwestern combina ambas técnicas y, específicamente, implica la identificación de ARN marcado que interactúa con proteínas inmovilizadas en una membrana de nitrocelulosa similar.

Edwin Southern fue el primero en crear la transferencia Southern , ^{[ 1 ]} una técnica analítica utilizada para detectar ADN. La técnica implica el uso de electroforesis en gel , un método analítico importante que implica el uso de un campo eléctrico y la posterior migración de ADN, ARN o proteínas cargadas a través de ese campo eléctrico según su tamaño y carga. ^{[ 2 ]} En una transferencia Southern, los fragmentos de ADN separados se transfieren a una membrana de filtro para su detección. ^{[ 1 ]} La detección ocurre cuando las bandas se hacen visibles en la membrana y se correlacionan con una molécula de interés en particular. ^{[ 2 ]} Posteriormente, se crearon otras técnicas de transferencia similares con una nomenclatura similar para detectar diferentes moléculas o interacciones entre moléculas. Estas técnicas incluyen la transferencia Western (detección de proteínas), la transferencia Northern (detección de ARN), la transferencia Southwestern (detección de interacción ADN-proteína), la transferencia Eastern (detección de modificación postraduccional) y la transferencia Northwestern (detección de interacción ARN-proteína). ^{[ 3 ] [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ]}

La realización de un análisis Northwestern blot implica la separación de las proteínas de unión al ARN mediante electroforesis en gel , que las separa según su tamaño y carga. Se pueden cargar muestras individuales en el gel de agarosa o poliacrilamida (generalmente SDS-PAGE) para analizar varias muestras simultáneamente. ^{[ 5 ]} Una vez completada la electroforesis en gel, este y las proteínas de unión al ARN asociadas se transfieren a un papel de transferencia de nitrocelulosa. ^{[ 7 ]}

Las membranas recién transferidas se sumergen en una solución de bloqueo; la leche desnatada y la albúmina sérica bovina son tampones de bloqueo comunes. ^{[ 8 ]} Esta solución de bloqueo ayuda a prevenir la unión inespecífica de los anticuerpos primarios y/o secundarios a la membrana de nitrocelulosa. Una vez que la solución de bloqueo tiene el tiempo de contacto adecuado con la membrana, se aplica un ARN competidor específico y se deja incubar a temperatura ambiente. Durante este tiempo, el ARN competidor se une a las proteínas de unión a ARN en las muestras que están en la membrana. El tiempo de incubación durante este proceso puede variar según la concentración del ARN competidor aplicado; aunque el tiempo de incubación suele ser de una hora. ^{[ 9 ]} Después de que la incubación se completa, la membrana generalmente se lava al menos 3 veces durante 5 minutos cada lavado, para diluir el ARN en la solución. Los tampones de lavado comunes incluyen solución salina tamponada con fosfato (PBS) o una solución de Tween 20 al 10 % . ^{[ 10 ]} Un lavado inadecuado o insuficiente afectará la claridad del desarrollo de la mancha. Una vez completado el lavado, la mancha se revela normalmente mediante rayos X o métodos de autorradiografía similares . ^{[ 11 ]}

Tras revelar la transferencia mediante rayos X o autorradiografía, los resultados pueden analizarse e interpretarse para determinar el tamaño y la concentración aproximados de la(s) proteína(s) de unión al ARN de interés y así estudiarla(s) con mayor profundidad. La ubicación y la concentración de la proteína de unión al ARN en la transferencia pueden afectar a los resultados, y en ocasiones pueden aparecer bandas tras el revelado. Estas bandas pueden ayudar a los investigadores a determinar el tamaño y la concentración de la proteína de unión al ARN de interés. ^{[ 12 ]} Cuando se conoce el tamaño aproximado de la proteína, la muestra original puede procesarse mediante cromatografía para separarla por tamaño. ^{[ 13 ]} Además, una vez aislada la proteína, puede digerirse con tripsina y utilizarse espectrometría de masas para secuenciar los péptidos y determinar la identidad de la proteína específica. ^{[ 14 ]}

Entre las ventajas de la transferencia Northwestern se incluyen la detección rápida de proteínas específicas que se unen al ARN, así como la determinación de los pesos moleculares aproximados de dichas proteínas. ^{[ 15 ]} La transferencia Northwestern permite la detección de proteínas identificadas de forma económica. Generalmente, constituye un primer paso en la investigación, ya que permite identificar los pesos moleculares aproximados; una vez conocido el peso molecular, facilita la investigación posterior o la purificación mediante otros métodos como la cromatografía. Otra ventaja de la transferencia Northwestern es que contribuye a la creación de bibliotecas de expresión de ligandos afines. ^{[ 16 ]}

Una desventaja notable es que algunas interacciones ARN-proteína con propiedades de unión al ARN deficientes pueden no ser tan detectables con esta técnica. ^{[ 15 ]} Además, el procedimiento de transferencia puede durar de 3 a 5 horas. Si el procedimiento no se realiza correctamente, puede generar un fondo significativo que puede resultar en una transferencia poco clara de las proteínas identificadas. Adicionalmente, las proteínas necesitan renaturalizarse después de ser separadas y transferidas a la membrana de nitrocelulosa. Una última desventaja es que las proteínas deben consistir en un solo polipéptido o dos subunidades que co-migran en la matriz del gel. ^{[ 17 ]}

• Southern blot
• Western blot
• Northern blot
• mancha del suroeste
• Eastern blot
• electroforesis en gel
• Página SDS
• Cromatografía

Análisis de interacción proteína-ARN mediante Western blot en panículas jóvenes de arroz.

Aislamiento de ARN y análisis Northern blot

Transferencia de proteínas