reacción en cadena de la polimerasa con extensión por solapamiento

La reacción en cadena de la polimerasa con extensión por solapamiento (o OE-PCR ) es una variante de la PCR . También se la conoce como PCR de empalme por extensión por solapamiento o por extensión por saliente (SOE) . Se utiliza para ensamblar múltiples fragmentos de ADN bicatenario más pequeños en una secuencia de ADN más grande. La OE-PCR se utiliza ampliamente para insertar mutaciones en puntos específicos de una secuencia o para ensamblar una secuencia de ADN personalizada a partir de fragmentos de ADN más pequeños en un polinucleótido más grande . ^{[ 1 ]}

Como en la mayoría de las reacciones de PCR, se utilizan dos cebadores —uno para cada extremo— por secuencia. Para empalmar dos moléculas de ADN, se emplean cebadores especiales en los extremos que se van a unir. Para cada molécula, el cebador del extremo a unir se diseña de forma que tenga un saliente 5' complementario al extremo de la otra molécula. Tras la hibridación, cuando se produce la replicación, el ADN se extiende mediante una nueva secuencia complementaria a la molécula a la que se va a unir. Una vez que ambas moléculas de ADN se han extendido de esta manera, se mezclan y se lleva a cabo una PCR utilizando únicamente los cebadores de los extremos opuestos. Las secuencias complementarias superpuestas introducidas servirán como cebadores y las dos secuencias se fusionarán. Este método presenta la ventaja, frente a otras técnicas de empalme genético, de no requerir sitios de restricción.

Para obtener mayores rendimientos, algunos cebadores se utilizan en exceso, como en la PCR asimétrica .

Para insertar una mutación en una secuencia de ADN, se diseña un cebador específico . Este cebador puede contener una sola sustitución o una nueva secuencia en su extremo 5'. Si se requiere una deleción , se añade una secuencia en el extremo 5' de la deleción, ya que el extremo 3' del cebador debe ser complementario a la cadena molde para que el cebador pueda unirse adecuadamente al ADN molde.

Tras la hibridación del cebador con la plantilla, la replicación del ADN continúa hasta el final de esta. El dúplex se desnaturaliza y el segundo cebador se une a la nueva cadena de ADN, que contiene la secuencia del primer cebador. La replicación prosigue para producir una cadena con la secuencia requerida, que contiene la mutación.

El dúplex se desnaturaliza de nuevo y el primer cebador puede unirse a la última hebra de ADN. La reacción de replicación continúa produciendo un fragmento de ADN completamente dimerizado . Tras varios ciclos de PCR para amplificar el ADN, la muestra se separa mediante electroforesis en gel de agarosa , seguida de electroelución para su recolección.

Generar oligonucleótidos de más de ~110 nucleótidos de forma eficiente es muy difícil. Por ello, para insertar una mutación más allá de la longitud permitida por un cebador de 110 nt, es necesario emplear PCR de extensión por solapamiento. En la PCR de extensión por solapamiento, la secuencia que se modifica se utiliza para crear dos hebras modificadas con la mutación en extremos opuestos, mediante la técnica descrita anteriormente. Tras la mezcla y la desnaturalización, se permite que las hebras se hibriden para producir tres combinaciones diferentes, como se detalla en el diagrama. Solo el dúplex sin solapamiento en el extremo 5' permitirá la extensión por la ADN polimerasa en dirección 3' a 5'.

Tras la extensión de la reacción OE-PCR, la mezcla de PCR o los fragmentos eluidos del tamaño adecuado se someten a una PCR normal, utilizando los cebadores externos empleados en las reacciones de PCR mutagénicas iniciales.

Además, la combinación de OE-PCR y PCR asimétrica podría utilizarse para mejorar la eficiencia de la mutagénesis dirigida al sitio . ^{[ 2 ]}

Además de la introducción de mutaciones, la PCR de extensión por solapamiento (OE-PCR) se utiliza ampliamente para ensamblar secuencias de ADN complejas sin la introducción de nucleótidos no deseados en ninguna posición. Esto es posible gracias a que la OE-PCR se basa en la utilización de extremos cohesivos complementarios para guiar el empalme sin dejar marcas de fragmentos de ADN personalizados en el orden deseado. Esta es la principal ventaja de la OE-PCR y otros métodos de clonación basados ​​en homología larga, como el ensamblaje de Gibson , que superan las limitaciones de los métodos tradicionales de clonación por digestión con enzimas de restricción y ligación . ^{[ 3 ]}

El ensamblaje de secuencias de ADN personalizadas mediante PCR de extensión por solapamiento (OE-PCR) consta de tres pasos principales. Primero, se amplifican secuencias de ADN individuales mediante PCR a partir de diferentes plantillas, flanqueadas con los extremos cohesivos complementarios necesarios. Segundo, los productos de PCR obtenidos se combinan en una reacción de PCR de extensión por solapamiento, donde los extremos cohesivos complementarios se unen por pares, permitiendo que la polimerasa extienda la cadena de ADN. Finalmente, se utilizan cebadores externos dirigidos a los extremos cohesivos externos y el producto de ADN deseado se amplifica en la reacción de PCR final.