PNGasa F

La péptido-N-glicosidasa F , comúnmente conocida como PNGasa F , es una amidasa de la clase de amidasas del péptido-N4-(N-acetil-beta-glucosaminil)asparagina . La PNGasa F funciona escindiendo entre los residuos más internos de GlcNAc y asparagina de oligosacáridos híbridos, complejos y con alto contenido de manosa de las glicoproteínas y glicopéptidos ligados a N. Esto da como resultado una proteína o péptido desaminado y un glicano libre . ^{[1] [2]}

La PNGasa F tiene un peso molecular de 35.500 y está formada por una cadena polipeptídica de 314 aminoácidos. ^[3] El pH óptimo para la actividad enzimática es 8,6. Sin embargo, la actividad es estable para una amplia variedad de condiciones y reactivos. La PNGasa F mantiene una actividad del 60 % desde un pH de 6,0 a un pH de 9,5. Es capaz de desglicosilarse en ausencia de desnaturalizantes, pero necesita una incubación extensa y mayores cantidades de la enzima para escindir las proteínas nativas. ^{[1] [4] [5]}

Otras endoglicosidasas , similares a la PNGasa F, incluyen la endoglicosidasa F1, la endoglicosidasa F2, la endoglicosidasa F3 y la endoglicosidasa H. ^{[6] [7] [8]} Estas endoglicosidasas tienen más especificidad en la escisión y son menos sensibles a la conformación de la proteína que la PNGasa F. ^{[1] [9] [10]} Todas estas endoglicosidasas, incluida la PNGasa F, se pueden purificar a partir de una emulsión de almendras o flavobacterium meningosepticum . ^{[1] [6] [10] [11] [12]}

La PNGasa F cataliza la escisión de un enlace glicósido interno en un oligosacárido. Escinde todos los oligosacáridos complejos, híbridos o con alto contenido de manosa unidos a asparagina, a menos que el núcleo de GlcNAc contenga una alfa 1,3-fucosa. ^[1]

El residuo de asparagina, del que se elimina el glicano, se desamina a ácido aspártico .

La PNGasa F requiere un mínimo de dos residuos de oligosacáridos GlcNAc unidos a la asparagina para que se produzca la catálisis. ^[12] Esta enzima utiliza una tríada catalítica de cisteína-histidina-aspartato en su sitio activo, que es un motivo común para las amidasas. Este motivo contiene un nucleófilo , un donante de protones y una carga positiva para estabilizar el intermedio tetraédrico . Se descubrió que la estructura cristalina de la PNGasa F de Flavobacterium miningosepticum, con una resolución de 1,8 Å, estaba plegada en dos dominios, cada uno con una configuración de barril β antiparalelo de ocho hebras , o rollo de gelatina. Esta estructura es similar a las lectinas y glucanasas , lo que sugiere similitudes con las lectinas y otras proteínas que se unen a los carbohidratos. ^[3]

Biológicamente, las deficiencias en endoglicosidasas pueden conducir a varias enfermedades, incluidas las enfermedades de almacenamiento lisosomal y las enfermedades multisistémicas, la mayoría de las cuales involucran al sistema nervioso. ^{[13] [14]} Los glicanos ligados a N pueden proporcionar componentes estructurales de las paredes celulares y matrices extracelulares, modificar la estabilidad y solubilidad de las proteínas, dirigir el tráfico de otras glicoproteínas y mediar la señalización celular (interacciones célula-célula e interacciones célula-matriz). ^[15] La glicosilación ligada a N se puede observar en anticuerpos , en superficies celulares y en varias proteínas en toda la matriz. Las alteraciones en la glicosilación a menudo se adquieren en casos de cáncer e inflamación, que pueden tener consecuencias funcionales importantes. ^[16]

Para tal fin, la PNGasa F y otras endoglicosidasas pueden utilizarse para estudiar oligosacáridos y caracterizar glicoproteínas. La PNGasa F carece de selectividad para la estructura externa de los carbohidratos, lo que resulta en una amplia especificidad, convirtiéndola en una herramienta útil para investigar la estructura y función de las glicoproteínas. ^[3] En la mayoría de los casos, las proteínas de interés se desnaturalizan y se tratan con PNGasa F. Después de esto, se someten a electroforesis en gel , en la que la migración de proteínas cambia debido a la desglicosilación por la PNGasa F, o se analizan mediante espectrometría de masas , por la que se puede caracterizar el oligosacárido y se puede caracterizar la proteína o el fragmento peptídico del que proviene. ^{[3] [7] [8]}