Etiqueta de extremos emparejados

Las etiquetas de extremos emparejados (PET) (a veces "diTags de extremos emparejados" o simplemente "ditags") son secuencias cortas en los extremos 5' y 3' de un fragmento de ADN que son lo suficientemente únicas como para que (teóricamente) existan juntas solo una vez en un genoma , por lo que la secuencia del ADN entre ellas está disponible en una búsqueda (si se dispone de datos de secuencia del genoma completo) o en una secuenciación posterior (ya que los sitios de las etiquetas son lo suficientemente únicos como para servir como sitios de hibridación de cebadores ). Las etiquetas de extremos emparejados (PET) existen en bibliotecas PET sin el ADN intermedio, es decir, una PET "representa" un fragmento más grande de ADN genómico o cDNA al consistir en una secuencia de enlace 5' corta, una etiqueta de secuencia 5' corta, una etiqueta de secuencia 3' corta y una secuencia de enlace 3' corta. Se demostró conceptualmente que 13 pares de bases son suficientes para mapear etiquetas de forma única. ^{[ 1 ]} Sin embargo, las secuencias más largas son más prácticas para mapear lecturas de forma única. Las endonucleasas (que se describen más adelante) utilizadas para producir PET generan etiquetas más largas (18/20 pares de bases y 25/27 pares de bases), pero las secuencias de 50 a 100 pares de bases serían óptimas tanto para el mapeo como para la eficiencia de costos. ^{[ 1 ]} Después de extraer las PET de muchos fragmentos de ADN, se enlazan (concatenan) para una secuenciación eficiente. En promedio, se podrían secuenciar de 20 a 30 etiquetas con el método de Sanger , que tiene una longitud de lectura mayor. ^{[ 1 ]} Dado que las secuencias de etiquetas son cortas, las PET individuales son adecuadas para la secuenciación de próxima generación que tiene longitudes de lectura cortas y mayor rendimiento. Las principales ventajas de la secuenciación de PET son su costo reducido al secuenciar solo fragmentos cortos, la detección de variantes estructurales en el genoma y una mayor especificidad al alinear de nuevo con el genoma en comparación con las etiquetas individuales, que involucran solo un extremo del fragmento de ADN.

Las bibliotecas de PET se preparan normalmente mediante dos métodos generales: basados ​​en la clonación y basados ​​en métodos sin clonación.

1. DNA-PET : Debido a que PET representa la conectividad entre las etiquetas, el uso de PET en la resecuenciación del genoma tiene ventajas sobre el uso de lecturas individuales . Esta aplicación se llama secuenciación de extremos por pares , conocida coloquialmente como secuenciación de escopeta de doble cañón . Anclar una mitad del par de forma única a una sola ubicación en el genoma permite mapear la otra mitad que es ambigua. Las lecturas ambiguas son aquellas que se mapean a más de una ubicación. Esta mayor eficiencia reduce el costo de la secuenciación, ya que estas secuencias o lecturas ambiguas normalmente se descartarían. La conectividad de las secuencias PET también permite la detección de variaciones estructurales: inserciones , deleciones , duplicaciones , inversiones , translocaciones . ^{[ 1 ] [ 4 ]} Durante la construcción de la biblioteca PET, los fragmentos se pueden seleccionar para que todos tengan un cierto tamaño. Después del mapeo, se espera que las secuencias PET estén consistentemente a una distancia particular entre sí. Una discrepancia con respecto a esta distancia indica una variación estructural entre las secuencias PET. Por ejemplo (Figura de la derecha): una deleción en el genoma secuenciado tendrá lecturas que se mapean más lejos de lo esperado en el genoma de referencia , ya que el genoma de referencia tendrá un segmento de ADN que no está presente en el genoma secuenciado.
2. ChIP-PET : El uso combinado deinmunoprecipitación de cromatina ( ChIP ) y PET se utiliza para detectar regiones de ADN unidas a una proteína de interés. ChIP-PET tiene la ventaja sobre la secuenciación de lectura única al reducir la ambigüedad de las lecturas generadas. La ventaja sobre la hibridación en chip ( ChIP-Chip ) es que los microarrays de hibridación no tienen la sensibilidad estadística que tienen las lecturas de secuencia. Sin embargo, ChIP-PET, ChIP-Seq ^{[ 5 ] [ 6 ] [ 7 ]} y ChIP-chip ^{[ 8 ]} han tenido un gran éxito. ^{[ 1 ]}
3. ChIA-PET : La aplicación de la secuenciación PET en el análisis de la interacción de la cromatina. Es una estrategia a nivel genómico para encontrarinteracciones de largo alcance de novo entre elementos de ADN unidos por factores proteicos. ^{[ 9 ]} El primer ChIA-PET fue desarrollado por Fullwood et al. (2009) ^{[ 9 ]} para generar un mapa de las interacciones entre la cromatina unida al receptor de estrógeno α (ER-α) en células de adenocarcinoma de mama humano tratadas con estrógeno. ^{[ 9 ]} ChIA-PET es una forma imparcial de analizar interacciones y estructuras de cromatina de orden superior porque puede detectar interacciones entre elementos de ADN desconocidos. En contraste, los métodos 3C y 4C se utilizan para detectar interacciones que involucran una región objetivo específica en el genoma. ChIA-PET es similar a encontrar genes de fusión a través de RNA-PET en que las etiquetas emparejadas se mapean a diferentes regiones en el genoma. ^{[ 1 ]} Sin embargo, ChIA-PET implica ligaciones artificiales entre diferentes fragmentos de ADN ubicados en diferentes regiones genómicas, en lugar de la fusión que ocurre naturalmente entre dos regiones genómicas como en RNA-PET.
4. RNA-PET : Esta aplicación se utiliza para estudiar el transcriptoma : transcripciones, estructuras genéticas y expresiones genéticas. ^{[ 1 ] [ 10 ]} La biblioteca PET se genera utilizando cDNAs de longitud completa, por lo que las ditags representan las firmas de la cola de poliA 5' caped y 3' de transcripciones individuales. Por lo tanto, RNA-PET es especialmente útil para delimitar los límites de las unidades de transcripción. Esto ayudará a identificar sitios de inicio de transcripción alternativos y sitios de poliadenilación de genes. ^{[ 1 ]} RNA-PET también podría utilizarse para detectar genes de fusión y trans-splicing , pero se necesita más experimentación para distinguirlos. ^{[ 11 ]} Otros métodos para encontrar los límites de las transcripciones incluyen las estrategias de etiqueta única CAGE , SAGE y la más reciente SuperSAGE , donde CAGE y 5' SAGE definen los sitios de inicio de transcripción y 3' SAGE define los sitios de poliadenilación . ^{[ 1 ]} Las ventajas de la secuenciación PET sobre estos métodos son que PET identifica ambos extremos de los transcritos y, al mismo tiempo, proporciona más especificidad al mapear de vuelta al genoma. La secuenciación de los cDNA puede revelar las estructuras de los transcritos con gran detalle, pero este enfoque es mucho más costoso que la secuenciación RNA-PET, especialmente para caracterizar todo el transcriptoma . ^{[ 10 ]} La principal limitación de RNA-PET es la falta de información sobre la organización de los exones internos de los transcritos. Por lo tanto, RNA-PET no es adecuado para detectar el empalme alternativo . Además, si el procedimiento de clonación se utiliza para construir la biblioteca de cDNA antes de generar los PET, los cDNA que son difíciles de clonar (como resultado de transcritos largos) tendrían una cobertura menor. ^{[ 10 ]} De manera similar, los transcritos (o isoformas de transcritos) con bajos niveles de expresión probablemente también estarían subrepresentados.