Abrazadera de parche

Durante un registro mediante la técnica de patch clamp, un tubo de vidrio hueco, conocido como micropipeta o pipeta de patch clamp, lleno de una solución electrolítica y con un electrodo de registro conectado a un amplificador, se pone en contacto con la membrana de una célula aislada . Otro electrodo, situado en un baño que rodea la célula o el tejido, actúa como electrodo de referencia . Se puede establecer un circuito eléctrico entre el electrodo de registro y el de referencia, con la célula de interés en medio.

La solución que llena la micropipeta puede coincidir con la composición iónica de la solución del baño, como en el caso del registro de célula intacta, o con la del citoplasma , para el registro de célula completa. La solución del baño puede coincidir con la solución extracelular fisiológica, con el citoplasma o ser completamente no fisiológica, según el experimento que se vaya a realizar. El investigador también puede modificar la composición de la solución del baño (o, con menos frecuencia, la de la solución de la micropipeta) añadiendo iones o fármacos para estudiar los canales iónicos en diferentes condiciones.

Dependiendo de lo que el investigador esté tratando de medir, el diámetro de la punta de la pipeta utilizada puede variar, pero generalmente está en el rango de los micrómetros . ^{[ 2 ]} Este pequeño tamaño se utiliza para delimitar un área de la superficie de la membrana celular o "parche" que a menudo contiene solo una o unas pocas moléculas de canal iónico. ^{[ 3 ]} Este tipo de electrodo se distingue del "microelectrodo afilado" utilizado para perforar células en registros intracelulares tradicionales , ya que se sella a la superficie de la membrana celular, en lugar de insertarse a través de ella.

En algunos experimentos, la punta de la micropipeta se calienta en una microforja para producir una superficie lisa que facilita la formación de un sello de alta resistencia con la membrana celular. Para obtener este sello de alta resistencia, la micropipeta se presiona contra la membrana celular y se aplica succión. Una porción de la membrana celular es succionada hacia la pipeta, creando un área de membrana en forma de omega que, si se forma correctamente, crea una resistencia en el rango de 10 a 100 gigaohmios , denominada "sello gigaohm" o "gigasello". ^{[ 3 ]} La alta resistencia de este sello permite aislar electrónicamente las corrientes medidas a través del parche de membrana con poco ruido de interferencia , además de proporcionar cierta estabilidad mecánica al registro. ^{[ 4 ]}

Muchos amplificadores de patch clamp no utilizan circuitos de fijación de voltaje propiamente dichos , sino que son amplificadores diferenciales que emplean el electrodo de baño para establecer el nivel de corriente cero (tierra). Esto permite al investigador mantener el voltaje constante mientras observa los cambios en la corriente . Para realizar estas grabaciones, la micropipeta de patch clamp se compara con el electrodo de tierra. A continuación, se inyecta corriente en el sistema para mantener un voltaje constante. La corriente necesaria para fijar el voltaje tiene signo opuesto y magnitud igual a la corriente que atraviesa la membrana. ^{[ 3 ]}

Alternativamente, la célula puede ser controlada mediante fijación de corriente en modo de célula completa, manteniendo la corriente constante mientras se observan los cambios en el voltaje de la membrana . ^{[ 5 ]}

El seccionamiento preciso de tejidos con vibrátomos compresstomos o micrótomos es esencial, además de los métodos de patch clamp. Al proporcionar cortes de tejido finos y uniformes, estos dispositivos permiten una implantación óptima de electrodos. Para preparar los tejidos para estudios de patch clamp de manera que se garanticen registros precisos y fiables, los investigadores pueden elegir entre el uso de vibrátomos para tejidos más blandos y micrótomos para estructuras más resistentes. ^{[ 6 ]} Leica Biosystems y Carl Zeiss AG son los principales fabricantes de estos dispositivos.

Para este método, la pipeta se sella a la membrana celular para obtener un gigasello (un sello con una resistencia eléctrica del orden de un gigaohmio), asegurando al mismo tiempo que la membrana celular permanezca intacta. Esto permite registrar corrientes a través de uno o pocos canales iónicos contenidos en el fragmento de membrana capturado por la pipeta. Al adherirse únicamente al exterior de la membrana celular, se produce una mínima alteración de la estructura celular. ^{[ 3 ]} Además, al no alterar el interior de la célula, cualquier mecanismo intracelular que normalmente influye en el canal podrá seguir funcionando como lo haría fisiológicamente. ^{[ 7 ]} Mediante este método también es relativamente fácil obtener la configuración adecuada, y una vez obtenida, es bastante estable. ^{[ 8 ]}

Para los canales iónicos regulados por ligando o modulados por receptores metabotrópicos , el neurotransmisor o fármaco en estudio suele incluirse en la solución de la pipeta, donde puede interactuar con la superficie externa de la membrana. La actividad del canal resultante se atribuye al fármaco utilizado, aunque generalmente no es posible modificar su concentración dentro de la pipeta. Por lo tanto, la técnica se limita a un punto de la curva dosis-respuesta por parche. En consecuencia, la curva dosis-respuesta se obtiene utilizando varias células y parches. Sin embargo, los canales iónicos dependientes de voltaje pueden mantenerse sucesivamente a diferentes potenciales de membrana en un solo parche. Esto da como resultado la activación del canal en función del voltaje, y se puede establecer una curva I-V (corriente-voltaje) completa en un solo parche. Otra posible desventaja de esta técnica es que, si bien las vías intracelulares no se ven afectadas, tampoco pueden modificarse directamente. ^{[ 8 ]}

En el método de adentro hacia afuera, un fragmento de la membrana se adhiere a la micropipeta, se separa del resto de la célula y la superficie citosólica de la membrana queda expuesta al medio externo o baño. ^{[ 9 ]} Una ventaja de este método es que el experimentador tiene acceso a la superficie intracelular de la membrana a través del baño y puede cambiar la composición química a la que está expuesta la superficie interna de la membrana. Esto es útil cuando un experimentador desea manipular el entorno en la superficie intracelular de canales iónicos individuales. Por ejemplo, los canales que se activan por ligandos intracelulares pueden estudiarse mediante un rango de concentraciones de ligando.

Para lograr la configuración de adentro hacia afuera, la pipeta se adhiere a la membrana celular como en el modo de unión celular, formando un gigasello, y luego se retrae para separar un fragmento de membrana del resto de la célula. Al separar un fragmento de membrana, a menudo se forma inicialmente una vesícula de membrana en la punta de la pipeta, ya que los extremos del fragmento se fusionan rápidamente después de la escisión. La cara externa de la vesícula debe abrirse para entrar en el modo de adentro hacia afuera; esto puede hacerse haciendo pasar brevemente la membrana a través de la interfaz solución/aire del baño, exponiéndola a una solución con bajo contenido de ^Ca²⁺ o haciendo contacto momentáneamente con una gota de parafina o un trozo de polímero de silicona curado . ^{[ 10 ]}

Los registros de célula completa implican registrar corrientes a través de múltiples canales simultáneamente, sobre una gran región de la membrana celular. El electrodo se deja en su lugar sobre la célula, como en los registros de célula adherida, pero se aplica más succión para romper el parche de membrana, proporcionando así acceso desde el interior de la pipeta al espacio intracelular de la célula. Esto proporciona un medio para administrar y estudiar cómo los tratamientos (por ejemplo, fármacos) pueden afectar a las células en tiempo real. ^{[ 11 ]} Una vez que la pipeta está adherida a la membrana celular, hay dos métodos para romper el parche. El primero es aplicando más succión. La cantidad y duración de esta succión dependen del tipo de célula y del tamaño de la pipeta. El otro método requiere que se envíe un gran pulso de corriente a través de la pipeta. La cantidad de corriente aplicada y la duración del pulso también dependen del tipo de célula. ^{[ 8 ]} Para algunos tipos de células, es conveniente aplicar ambos métodos simultáneamente para romper el parche.

La ventaja del registro de pinzamiento de parche de célula completa sobre el registro con electrodo afilado es que la mayor abertura en la punta del electrodo de pinzamiento de parche proporciona menor resistencia y, por lo tanto, mejor acceso eléctrico al interior de la célula. ^{[ 12 ] [ 11 ]} Una desventaja de esta técnica es que, debido a que el volumen del electrodo es mayor que el volumen de la célula, el contenido soluble del interior celular se reemplazará lentamente por el contenido del electrodo. Esto se conoce como "dialización" del contenido celular por parte del electrodo. ^{[ 8 ]} Después de un tiempo, cualquier propiedad de la célula que dependa del contenido intracelular soluble se verá alterada. La solución de la pipeta utilizada generalmente se aproxima al entorno de alto potasio del interior de la célula para minimizar cualquier cambio que esto pueda causar. A menudo hay un período al comienzo de un registro de célula completa en el que se pueden tomar mediciones antes de que la célula se haya dializado. ^{[ 8 ]}

El nombre "de afuera hacia afuera" enfatiza tanto la complementariedad de esta técnica con la técnica de adentro hacia afuera, como el hecho de que coloca la superficie externa en lugar de la intracelular de la membrana celular en el exterior del parche de membrana, en relación con el electrodo de parche. [ ^{7 ]}

La formación de un parche de membrana de afuera hacia afuera comienza con una configuración de registro de célula completa. Una vez formada esta configuración, el electrodo se retira lentamente de la célula, permitiendo que se forme una protuberancia de membrana . Cuando el electrodo se retira lo suficiente, esta protuberancia se desprende de la célula y se reforma como una membrana convexa en el extremo del electrodo (como una esfera abierta en la punta del electrodo), con la superficie exterior original de la membrana orientada hacia afuera del electrodo. ^{[ 7 ]} Como muestra la imagen de la derecha, esto significa que el fluido dentro de la pipeta simulará el fluido intracelular, mientras que el investigador puede mover la pipeta y la protuberancia con sus canales a otro baño de solución. Si bien pueden existir múltiples canales en una protuberancia de membrana, también es posible realizar registros de un solo canal en esta conformación si la protuberancia de membrana desprendida es pequeña y contiene solo un canal. ^{[ 13 ]}

La técnica de parcheo de membrana externa permite al experimentador examinar las propiedades de un canal iónico cuando se aísla de la célula y se expone sucesivamente a diferentes soluciones en la superficie extracelular de la membrana. El experimentador puede perfundir el mismo parche con diversas soluciones en un tiempo relativamente corto, y si el canal se activa mediante un neurotransmisor o un fármaco desde la cara extracelular, se puede obtener una curva dosis-respuesta . ^{[ 14 ]} Esta capacidad de medir la corriente a través de la misma porción de membrana en diferentes soluciones es la principal ventaja del parcheo de membrana externa en comparación con el método de parcheo de membrana adherido a la célula. Sin embargo, es más difícil de realizar. El proceso de formación, más prolongado, implica más pasos que podrían fallar y resulta en una menor frecuencia de parches utilizables.

Esta variación del método de patch clamp es muy similar a la configuración de célula completa. La principal diferencia radica en que, cuando el experimentador forma el sello de gigaohmios, no se utiliza succión para romper la membrana del parche. En cambio, la solución del electrodo contiene pequeñas cantidades de un agente antifúngico o antibiótico , como anfotericina B , nistatina o gramicidina , que se difunde en el parche de membrana y forma pequeños poros en la membrana, proporcionando acceso eléctrico al interior de la célula. ^{[ 15 ]} Al comparar los métodos de célula completa y parche perforado, se puede pensar en el parche de célula completa como una puerta abierta, en la que hay un intercambio completo entre las moléculas de la solución de la pipeta y el citoplasma. El parche perforado se puede comparar con una puerta mosquitera que solo permite el intercambio de ciertas moléculas de la solución de la pipeta al citoplasma de la célula.

Las ventajas del método de parche perforado, en comparación con los registros de célula completa, incluyen las propiedades de los poros antibióticos, que permiten el equilibrio solo de iones monovalentes pequeños entre la pipeta de parche y el citosol, pero no de moléculas más grandes que no pueden permear a través de los poros. Esta propiedad mantiene los niveles endógenos de iones divalentes como Ca ²⁺ y moléculas de señalización como cAMP . En consecuencia, se pueden obtener registros de la célula completa, como en el patch clamping de célula completa, mientras se conservan la mayoría de los mecanismos de señalización intracelular, como en los registros de célula adherida. Como resultado, hay una disminución reducida de la corriente y los registros estables de parche perforado pueden durar más de una hora. ^{[ 15 ]} Las desventajas incluyen una mayor resistencia de acceso, en comparación con la célula completa, debido a que la membrana parcial ocupa la punta del electrodo. Esto puede disminuir la resolución de la corriente y aumentar el ruido de registro. También puede llevar bastante tiempo que el antibiótico perfore la membrana (unos 15 minutos para la anfotericina B, e incluso más para la gramicidina y la nistatina). La membrana bajo la punta del electrodo se debilita por las perforaciones que forma el antibiótico y puede romperse. Si el parche se rompe, el registro se realiza en modo de célula completa, con el antibiótico contaminando el interior de la célula. ^{[ 15 ]}

La técnica de patch clamp con sellado suelto se diferencia de las demás técnicas aquí descritas en que emplea un sellado suelto (baja resistencia eléctrica) en lugar del sellado hermético utilizado en la técnica convencional. Esta técnica se empleó ya en 1961, como se describe en un artículo de Strickholm sobre la impedancia de la superficie de una célula muscular, ^{[ 16 ]} pero recibió poca atención hasta que Almers, Stanfield y Stühmer la retomaron y le dieron un nombre en 1982, ^{[ 17 ]} después de que el patch clamp se hubiera consolidado como una herramienta fundamental de la electrofisiología.

Para lograr un patch clamp laxo en una membrana celular, la pipeta se mueve lentamente hacia la célula, hasta que la resistencia eléctrica del contacto entre la célula y la pipeta aumenta a una resistencia varias veces mayor que la del electrodo solo. Cuanto más cerca esté la pipeta de la membrana, mayor será la resistencia de la punta de la pipeta, pero si está demasiado cerca se forma un sello, y podría ser difícil retirar la pipeta sin dañar la célula. En la técnica de patch clamp laxo, la pipeta no se acerca lo suficiente a la membrana como para formar un gigasello o una conexión permanente, ni para perforar la membrana celular. ^{[ 18 ]} La membrana celular permanece intacta, y la falta de un sello hermético crea un pequeño espacio a través del cual los iones pueden pasar fuera de la célula sin entrar en la pipeta.

Una ventaja significativa del sellado laxo es que la pipeta utilizada puede retirarse repetidamente de la membrana después del registro, y la membrana permanecerá intacta. Esto permite realizar mediciones repetidas en diversas ubicaciones de la misma célula sin dañar la integridad de la membrana. Esta flexibilidad ha sido especialmente útil para los investigadores que estudian las células musculares durante su contracción en condiciones fisiológicas reales, obteniendo registros rápidamente y sin recurrir a medidas drásticas para detener la contracción de las fibras musculares. ^{[ 17 ]} Una desventaja importante es que la resistencia entre la pipeta y la membrana se reduce considerablemente, lo que permite que la corriente se filtre a través del sellado y reduce significativamente la resolución de corrientes pequeñas. Sin embargo, esta fuga puede corregirse parcialmente, lo que ofrece la oportunidad de comparar registros realizados en diferentes áreas de la célula de interés. Por ello, se ha estimado que la técnica de parche laxo puede detectar corrientes inferiores a 1 mA/ ^cm² . ^{[ 18 ]}

Este método, que combina imágenes celulares, secuenciación de ARN y patch clamp, se utiliza para caracterizar completamente las neuronas a través de múltiples modalidades. ^{[ 19 ]} Dado que los tejidos neuronales son una de las poblaciones celulares con mayor diversidad transcriptómica , clasificar las neuronas en tipos celulares para comprender los circuitos que forman representa un gran desafío para los neurocientíficos. Combinar los métodos de clasificación clásicos con la secuenciación de ARN de células individuales a posteriori ha demostrado ser difícil y lento. Al combinar múltiples modalidades de datos, como electrofisiología , secuenciación y microscopía , Patch-seq permite caracterizar las neuronas de múltiples maneras simultáneamente. Actualmente, presenta un bajo rendimiento en comparación con otros métodos de secuenciación, principalmente debido al trabajo manual necesario para lograr un registro de patch clamp exitoso en una neurona. Actualmente se están realizando investigaciones para automatizar la tecnología de patch clamp, lo que también mejorará el rendimiento de patch-seq. ^{[ 20 ]}