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Evolución continua asistida por fagos

La evolución continua asistida por fagos ( PACE ) es una técnica basada en fagos para la evolución dirigida y automatizada de proteínas. Se basa en relacionar la actividad desea...

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La evolución continua asistida por fagos ( PACE ) es una técnica basada en fagos para la evolución dirigida y automatizada de proteínas. Se basa en relacionar la actividad deseada de una proteína diana con la aptitud de un bacteriófago infeccioso que porta el gen correspondiente a dicha proteína. Por lo tanto, las proteínas con mayor actividad deseada confieren mayor infectividad a su fago portador. Un mayor número de fagos infecciosos se propaga con mayor eficacia, seleccionando mutaciones ventajosas. La variación genética se genera mediante polimerasas propensas a errores en los vectores de fagos , y con el tiempo la proteína acumula mutaciones beneficiosas. Esta técnica destaca por realizar cientos de rondas de selección con una mínima intervención humana.

Principio

El componente central de PACE es un recipiente de volumen fijo conocido como la “laguna”. La laguna contiene vectores de bacteriófagos M13 que portan el gen de interés (conocido como plásmido de selección o SP), así como células huésped de E. coli que permiten la replicación del fago. La laguna se diluye constantemente mediante la adición y el drenaje de un medio líquido que contiene células de E. coli . El caudal del líquido se ajusta de manera que la tasa de dilución sea más rápida que la tasa de reproducción de E. coli , pero más lenta que la tasa de reproducción del fago. Por lo tanto, hay un suministro constante de células de E. coli en la laguna, pero el fago solo puede mantenerse mediante una replicación suficientemente rápida. [ 1 ]

La replicación del fago requiere la infección de E. coli , que, para el fago M13, depende de la proteína III (pIII). [ 2 ] Al usar PACE, los vectores de fago carecen del gen para producir pIII. En cambio, la producción de pIII está ligada a la actividad de la proteína de interés a través de un mecanismo que varía según el caso de uso, a menudo involucra un plásmido adicional que contiene el gen III (gIII) que expresa pIII, conocido como plásmido accesorio o AP. Cabe destacar que la producción de fagos infecciosos aumenta con la producción de pIII. [ 3 ] Por lo tanto, cuanto mayor sea la actividad de la proteína, mayor será la tasa de producción de pIII y más fagos infecciosos se generarán para ese gen en particular.

Mediante el uso de polimerasas propensas a errores (codificadas en el plásmido de mutagénesis, o MP), se introduce variación genética en la porción del gen de la proteína de los vectores fágicos. Debido a las presiones selectivas ejercidas por el drenaje constante de la laguna, solo los fagos que pueden replicarse con la suficiente rapidez pueden permanecer en ella, por lo que con el tiempo se acumulan mutaciones beneficiosas en los fagos que se replican en la laguna. De esta manera, se realizan continuamente rondas de evolución, lo que permite que transcurran cientos de rondas con poca intervención humana. [ 1 ]

Descripción general de PACE
Esquema general de PACE. MP significa plásmido de mutagénesis y codifica las proteínas necesarias para introducir mutaciones en SP. SP significa plásmido de selección y codifica el gen del bacteriófago M13 sin gIII, así como el gen de interés. AP significa plásmido accesorio y contiene gIII, así como un método para inducir la transcripción de gIII.

Aplicaciones

Especificidad del promotor de la polimerasa

En el artículo inicial que fue pionero en esta técnica, las ARN polimerasas T7 evolucionaron para reconocer diferentes promotores , como los promotores T3 o SP6. [ 4 ] Esto se logró haciendo que el promotor objetivo fuera el único promotor para gIII. [ 5 ] Por lo tanto, las polimerasas mutantes con mayor especificidad para el promotor deseado causaron una mayor producción de pIII. Esto resultó en polimerasas con una actividad aproximadamente 3-4 órdenes de magnitud mayor para el promotor objetivo que el promotor T3 original. [ 4 ] Si bien este sistema PACE original solo realizaba selección positiva, se desarrolló una variante que permitía también la selección negativa. Esto se logra vinculando la actividad no deseada a la producción de pIII no funcional, lo que disminuye la cantidad de fago infeccioso producido. [ 6 ]

PACE en polimerasas
Esquema para la evolución de la especificidad del promotor de la polimerasa mediante PACE. La ARN polimerasa T7 con mutaciones que dificultan la unión al promotor T3 no produce transcripción de gIII. Sin embargo, las mutaciones que permiten la unión al promotor T3 aumentan la transcripción de gIII.

Especificidad del sustrato de la proteasa

Se han desarrollado proteasas para cortar diferentes péptidos mediante PACE. En estos sistemas, el sitio de corte deseado de la proteasa se utiliza para unir una ARN polimerasa T7 y una lisozima T7 . La lisozima T7 impide que la polimerasa T7 transcriba gIII. Cuando se escinde el péptido enlazador, se activa la polimerasa T7, lo que permite la transcripción del gen pIII. Este método se utilizó para crear una proteasa TEV con un sustrato peptídico significativamente diferente. [ 6 ] [ 7 ]

PACE en proteasas
Esquema para utilizar PACE y modificar la actividad de la proteasa. Cuando la ARN polimerasa T7 y la lisozima T7 están unidas, se bloquea la transcripción de gIII. Cuando la proteasa se activa en el sitio de escisión, la polimerasa T7 se libera, permitiendo la transcripción de gIII.

Sintetasas de aminoacil-ARNt ortogonales

Utilizando PACE, también se desarrollaron aminoacil-ARNt sintetasas (aaRS) para aminoácidos no canónicos . La actividad de una aaRS está ligada a la producción de pIII mediante la adición de un codón de parada TAG en medio de gIII. Las sintetasas que aminoacilan el ARNt supresor del codón TAG impiden la actividad del codón de parada , lo que permite la producción de pIII funcional. Utilizando este sistema, se desarrollaron aaRS que utilizan los aminoácidos no canónicos p -nitrofenilalanina, yodofenilalanina y Boc-lisina. [ 8 ]

RITMO en aaRSs
Esquema para utilizar PACE y desarrollar aminoacil-ARNt sintetasas ortogonales. Sin la actividad de la sintetasa, la ARN polimerasa T7 no puede traducirse completamente debido a la presencia de un codón de parada ámbar. Al introducir una sintetasa funcional para el ARNt con codón ámbar, este codón de parada ámbar ahora codifica un aminoácido no canónico, lo que permite la transcripción completa de la ARN polimerasa T7 y, por lo tanto, la transcripción de gIII.

Interacciones proteína-proteína

Las interacciones proteína-proteína también se han desarrollado mediante PACE. En este método, la proteína diana se fusiona con una proteína de unión al ADN, que se une a una secuencia diana ubicada corriente arriba del promotor gIII. La proteína en proceso de evolución se fusiona con una ARN polimerasa. Cuanto mejor sea la interacción proteína-proteína, mayor será la transcripción de pIII, lo que permite la evolución de la interacción proteína-proteína en condiciones PACE. [ 6 ] Este método se utilizó para desarrollar variantes de endotoxina de Bacillus thuringiensis capaces de superar la resistencia a toxinas de insectos. [ 6 ] [ 9 ]

PACE para interacciones proteína-proteína
Esquema para utilizar PACE en la evolución de interacciones proteína-proteína. La proteína diana, en púrpura, está fusionada a una proteína de unión al ADN, en azul. La proteína en evolución, en rojo, está unida a una ARN polimerasa funcional, en verde. Al unir la proteína de unión al ADN corriente arriba del promotor gIII, una unión más favorable entre la proteína diana y la proteína en evolución conduce a una mayor transcripción de gIII.

Editores base

Se utilizó PACE para evolucionar APOBEC1 para una mayor expresión soluble. APOBEC1 es una citidina desaminasa que se ha utilizado en editores de bases para catalizar la edición de un solo nucleótido C-->T. [ 10 ] En E. coli , APOBEC1 generalmente cae de la solución a la fracción insoluble. [ 11 ] Para evolucionar APOBEC1 para una mejor expresión soluble, el extremo N de una polimerasa T7 se fusionó a APOBEC1, con la porción restante de la polimerasa expresada por separado. La polimerasa T7 solo puede funcionar cuando la porción del extremo N puede unirse al resto de la polimerasa. Dado que APOBEC1 debe plegarse correctamente para que la porción del extremo N se exponga adecuadamente, la actividad de la polimerasa T7 está correlacionada con el plegamiento de APOBEC1. Por lo tanto, la transcripción y producción de pIII está vinculada con la expresión soluble de APOBEC1 a través de la polimerasa T7. Utilizando este enfoque, la expresión soluble de APOBEC1 aumentó 4 veces sin cambios en la función. [ 7 ] [ 9 ]

PACE para una expresión soluble mejorada
Esquema para la ingeniería de la expresión soluble elevada. POI = proteína de interés. Cuando la POI se pliega correctamente, la porción T7n queda expuesta, lo que permite la unión a la porción T7c para formar una ARN polimerasa T7 completamente funcional. Esta ARN polimerasa T7 puede entonces transcribir gIII. Si la POI se pliega incorrectamente, la ARN polimerasa T7 no se forma, lo que impide la transcripción de gIII.

PACE también se utilizó para crear una desoxiadenosina desaminasa catalíticamente más activa. La desoxiadenosina desaminasa se utiliza en editores de bases para realizar la edición de un solo nucleótido A-->T. Esto se logró insertando codones de parada que contienen adenosina en el gen de la polimerasa T7. Si el editor de bases es capaz de corregir el error, se produce una polimerasa T7 funcional, lo que permite la producción de pIII. Mediante este sistema, desarrollaron una desoxiadenosina desaminasa con una actividad 590 veces mayor que la del tipo silvestre. [ 12 ]

PACE para una mayor actividad de la desoxiadenosina desaminasa
Evolución de desoxiadenosina desaminasas de mayor actividad mediante PACE. En este caso, el gen de la ARN polimerasa T7 contiene dos codones de parada, ambos con nucleótidos de adenosina. Sin la actividad de la desoxiadenosina desaminasa, la ARN polimerasa T7 resultante está truncada y, por lo tanto, no es funcional. Sin embargo, con una desoxiadenosina desaminasa funcional, los codones de parada se convierten en codones que codifican aminoácidos, lo que permite la producción de una ARN polimerasa T funcional, que puede transcribir gIII.

Referencias

  1. 1 2 Esvelt, K.; Carlson, J.; Liu, DR (2011). "Un sistema para la evolución dirigida continua de biomoléculas" . Nature . 472 ( 7344): 499– 503. Bibcode : 2011Natur.472..499E . doi : 10.1038/nature09929 . PMC 3084352. PMID 21478873 .  
  2. ↑ Riechmann, L.; Holliger, P. (1997). "El dominio C-terminal de TolA es el correceptor para la infección por fagos filamentosos de E. coli " . Cell . 90 (2): 351– 360. doi : 10.1016/s0092-8674(00)80342-6 . PMID 9244308 . 
  3. ↑ Rakonjac, J.; Model, P. (1998). "Funciones de pIII en el ensamblaje de fagos filamentosos". J. Mol. Biol . 282 (1): 25– 41. doi : 10.1006/jmbi.1998.2006 . PMID 9733639 . 
  4. 1 2 Lane, MD; Seelig, B. (2014). "Avances en la evolución dirigida de proteínas" . Curr. Opin. Chem. Biol . 22 : 129–136 . Bibcode : 2014COCB...22..129L . doi : 10.1016 / j.cbpa.2014.09.013 . PMC 4253873. PMID 25309990 .  
  5. ↑ Lemire, S.; Yehl, KM; Lu, TK (2018). "Aplicaciones basadas en fagos en biología sintética" . Annu . Rev. Virol . 5 (1): 453– 476. doi : 10.1146/annurev-virology-092917-043544 . PMC 6953747. PMID 30001182 .  
  6. 1 2 3 4 Brödel, AK; Isalan, M.; Jaramillo, A. (2018). "Ingeniería de biomoléculas mediante evolución dirigida por bacteriófagos" . Curr. Opin. Biotech . 51 : 32–38 . doi : 10.1016/j.copbio.2017.11.004 . hdl : 10261/184372 . PMID 29175708 . 
  7. 1 2 Kim, JY; Yoo, HW; Lee, PG; Lee, SG; Seo, JH; Kim, BG (2019). " Evolución de proteínas in vivo , estrategia de ingeniería de proteínas de próxima generación: del enfoque aleatorio al enfoque específico del objetivo". Biotechnol. Bioproc. E . 24 : 85– 94. doi : 10.1007/s12257-018-0394-2 . S2CID 91687131 . 
  8. ↑ Vargas-Rodriguez, O.; Sevostyanova, A.; Söll, D.; Crnković, A. (2018). "Actualización de las aminoacil-ARNt sintetasas para la expansión del código genético" . Curr . Opin. Chem. Biol . 46C : 115–122 . doi : 10.1016/j.cbpa.2018.07.011 . PMC 7083171. PMID 30056281 .  
  9. 1 2 Simon, AJ; d'Oelsnitz, S .; Ellington, AD (2018). "Evolución sintética". Nat. Biotechnol . 37 (7): 730– 743. doi : 10.1038/s41587-019-0157-4 . PMID 31209374. S2CID 189927244 .  
  10. ↑ Gaudelli, NM; Komor, AC; Rees, HA; Packer, MS; Badran, AH; Bryson, DI; Liu, DR (2017). " Edición programable de bases de A·T a G·C en ADN genómico sin escisión de ADN" . Nature . 551 (7681): 464– 471. doi : 10.1038/nature24644 . PMC 5726555. PMID 29160308 .  
  11. ↑ Wang, T.; Badran, AH; Huang, TP; Liu, DR (2018). "Evolución dirigida continua de proteínas con expresión soluble mejorada" . Nat . Chem. Biol . 14 (10): 972– 980. doi : 10.1038/s41589-018-0121-5 . PMC 6143403. PMID 30127387 .  
  12. ↑ Richter, MF; Zhao, KT; Eton, E.; Lapinaite, A.; Newby, GA; Thuronyi, BW; Wilson, C.; Koblan, LW; Zeng, J.; Bauer, DE; Doudna, JA; Liu, DR (2020). " Evolución asistida por fagos de un editor de bases de adenina con compatibilidad y actividad mejoradas del dominio Cas" . Nat. Biotechnol . 38 (7): 883– 891. doi : 10.1038/s41587-020-0453-z . PMC 7357821. PMID 32433547 .  
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